预习实验报告一：蛋白质含量测定方法的研究
一、研究背景
目前常用的有四种蛋白质含量测定方法：凯氏定氮、Folin-酚法、染料结合法、
紫外法，最常用的是后三种。由于实验材料来源的多样性，每种材料的非蛋白干扰因素不尽相同，所以对于同一类甚至同一物质的测定会有不同的方法，在实际工作中应根据实验材料的具体特点来选用合适的测定方法。
二、研究目标
通过实验研究非蛋白干扰因素（核酸、淀粉、脂类等）对不同蛋白质含量测定
方法是否有差异影响，再根据结论进一步进行后续实验，最后找到选择合适测定方法的依据。
三、研究策略
对于小麦、玉米或其他谷物制成的样品液，非蛋白干扰因素主要为淀粉和脂类，
用后三种方法分别对该样品液进行蛋白含量测定，综合数据，对结果进行分析，是否有差异；对于绿豆芽下胚轴制成的样品液，非蛋白干扰因素主要为核酸，用后三种方法分别对该样品液进行蛋白含量测定，综合数据，对结果进行分析，是否有差异。
四、研究方案及可行性分析
紫外法测定：由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280毫微米波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度指与其浓度成正比关系，可作定量测定。技术上有紫外分光光度计支持。
Folin-酚法测定：根据蛋白质侧链基团中的特殊残基进行含量测定，基础是蛋白质中所含的酪氨酸和色氨酸等残基数与蛋白质含量成正比。Folin-酚试剂由试剂甲（相当于双缩脲试剂）和试剂乙（磷钨酸和磷钼酸混合液）组成，蛋白质中的肽键与试剂甲生成络合物，由于蛋白质中存在含有酚基的氨基酸，络合物可与试剂乙发生反应，反应颜色与蛋白质的含量成正比，从而可以据此测定蛋白质的含量。
染料结合法测定：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0-1000μg/ml），蛋白质—色素络合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，可用于蛋白质含量的测定。
预期实验结果：对于两种样品液，分别用后三种方法测定蛋白质含量，数据间存在差异，说明非蛋白干扰因素（核酸、淀粉、脂类等）对不同蛋白质含量测定方法有影响，这几种方法都有其存在的价值，不同的实验材料适合不同的测定方法。
五、具体实验设计
实验材料（共同用到）：小麦、玉米或其他谷物制成的样品液、绿豆芽下胚轴制成的样品液。 紫外法测定：
1.实验试剂：1mg/ml的标准牛血清蛋白溶液、浓度约为1mg/ml的待测蛋白质溶液。 2.实验仪器：紫外分光光度计、移液管、试管和试管架。 3.实验步骤： ⑴标准曲线的制作
管号 dH2O（ml） OD280 按上表分别向每支试管加入各种试剂，混匀。选用光程为1㎝的石英比色杯（手拿磨砂面,2/3-3/4），在280nm下测其光密度值（OD280）。以OD值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 ⑵待测蛋白溶液的测定
取待测液1ml，加入蒸馏水3ml，混匀，测其OD280然后由标准曲线上查得待测液的蛋白质浓度。
⑶两种样品溶液的蛋白含量测定
将待测溶液稀释至光密度在0.2—2.0之间，在波长260nm和280nm处，分别测出光密度（OD260、OD280）。计算OD280/OD260的比值后，由紫外分光光度法测定蛋白质含量校正数据表（由于不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽然经过校正，测定结果仍存在一定误差）查出校正因子“F”，将F值代入下面的经验公式直接算出该溶液的蛋白质浓度。
公式：蛋白质浓度（mg/ml）=F×（1/d）×OD280×D 式中：OD280为该溶液在280nm下的紫外吸收、d为石英比色杯的厚度（cm）、D为溶液的稀释倍数 Folin-酚法
1.实验试剂：Folin-酚试剂(试剂甲、试剂乙)、配置的浓度为250μg/ml的牛血清白蛋白标准溶液。
2.实验仪器：722型分光光度计、恒温水浴、具塞刻度试管：15ml×8、小烧杯×2、漏斗及架、分析天平、移液管：0.5 ml×1,1ml×2,5 ml×1、容量瓶：50ml×1、研钵。
1 2 3 1.0 3.0 4 1.5 2.5 5 2.0 2.0 6 2.5 1.5 7 1.0 8 0 标准蛋白溶液（ml） 0 0.5 4 3.5 3.0 4.0 蛋白质浓度（mg/ml） 0 0.125 0.25 0.375 0.50 0.625 0.75 1.0 3.实验步骤 ⑴标准曲线的制作
牛血清白蛋白标准溶液的配制：
取具塞试管6支，按下表加入牛血清白蛋白标准溶液及蒸馏水，以后各加试剂甲5ml（形成络合物）,混合后在室温下放置10分钟，再加0.5ml试剂乙（产生蓝色反应），立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。半小时后，以不含蛋白质的1号试管为对照，与其它5支试管内的溶液依次用722型分光光度计于650nm波长下比色，记录各试管内溶液的消光值。 管号 标准BSA（ml） 蒸馏水（ml） 蛋白质含量（ml） 制标准曲线。 ⑵样品测定
称取绿豆芽下胚轴1g于研钵中，加入适当石英砂，匀浆。转入50ml容量瓶中，定容，过滤，滤液即为样品液。
取具塞试管2支，分别加入样品液1ml，分别加入试剂甲5ml，混匀后放置10min，然后各加试剂乙0.5ml，迅速混匀，室温下放置半小时，于650nm波长下比色，记录消光值，取其平均值完成计算。 4.结果与计算
从标准曲线中查出测定液中蛋白质的含量（μg/ml）,然后计算样品中蛋白质的百分含量。
染料结合法测定：
1.实验试剂：牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、乙醇、磷酸（85%）。
2.实验仪器：711型或722型分光光度计、离心机、分析天平（万分之一）、药物天平、量筒10ml×1、研钵、烧杯、量瓶10ml×1、刻度吸管：1ml×2，0.1ml×2、具塞刻度试管：10ml×4、漏斗及架、剪刀。 3.实验步骤 ⑴标准曲线的制作
0-100μg/ml标准曲线的制作：
取6支试管，按下表数据配置0-100μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml：
1 0 1.0 0 2 0.2 0.8 50 3 0.4 0.6 100 4 0.6 0.4 150 5 0.8 0.2 200 6 1.0 0 250 标准曲线的绘制：以消光值为纵坐标，以牛血清白蛋白含量（μg/ml）为横坐标，绘
准确吸取所配置各管溶液1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，盖塞，将试管中溶液纵向倒转混合放置2分钟后用10mm光径的比色杯（对考马斯亮蓝G-250吸附厉害，可能会不干净）在595nm下比色，做出标准曲线。 管号 蒸馏水（ml） 蛋白质含量（μg/ml） 0-100μg/ml标准曲线的制作：
另取6支试管，按下表数据配置0-100μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml： 与前面步骤相同，做出标准曲线。
管号 蒸馏水（ml） 蛋白质含量（μg/ml） ⑵样品提取液中蛋白质浓度的测定：
称取新鲜绿豆芽下胚轴3g放入研钵中，滴加适量蒸馏水调成匀浆转移至离心管中，再用适量蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，稍事搅拌，放置半小时至一个小时（充分提取），然后在4000转/分离心20min，弃去沉淀，上清液转入容量瓶，以蒸馏水定容至50ml待测。
测定：吸取提取液1ml（做一个平行），放入具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用10mm光径的比色杯在595nm下比色，记录消光值，并通过标准曲线查得毫升溶液中蛋白质的含量，以标准曲线1号试管做空白。 4.结果与计算
式中：A为标准曲线上查得的蛋白质含量，单位为μg/ml
原始数据记录： 小麦、玉米或其他谷物的蛋白质含量 绿豆芽下胚轴的蛋白质含量
紫外法 Folin-酚法 染料结合法 7 8 9 10 11 12 0 100μg/ml牛血清白蛋白标准原液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 200 400 600 800 1000 1 2 3 4 5 6 100μg/ml牛血清白蛋白标准原液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 60 80 100 时间安排及分工协作：预计一下午完成实验，充分利用时间，两个样品溶液两个人各配一个，对于需要配置一系列浓度梯度的，我们决定一个人配置，另一个人测其光密度值或光吸收值并记录数据，做下一个样品溶液实验时，两个人的工作互换，这样都可以得到锻炼。
六、质疑及相关思考
⑴Folin-酚法和染料结合法测定的实验指导中，关于绿豆芽下胚轴的样品液制作不相同，不知道对于结果是否会造成影响。
⑵过滤掉的物质里面是否还会残留有不可忽略的蛋白质。
⑶非蛋白质因素很多，本次实验主要通过探究核酸、淀粉及脂质对蛋白质含量测定的影响就可说明非蛋白因素对其有影响吗。 预习提问回答：
1.⑴明确目标物质，清楚目标物质与杂物质的主要性质，找到目标物质区别于杂物质的性质。
⑵利用该性质寻找合适的分离技术，尽可能减少操作步骤，减少目标物质损失。 ⑶如有要求，还要保证目标物质的活性。
2.⑴分子质量大⑵具有一定的形状，空间结构⑶具有一些特殊的化学性质及物理性质：如特异性、带电性、变性与复性、亲疏水性、还原性及非还原性等
分离纯化时应注意：针对一个特点进行分离纯化时，其它特点可能会对分离纯化的结果产生影响，实际操作时，要综合考虑，不要破坏其结构，保持其活性。
3.使用缓冲液原因：缓冲液可保证体系处于实验所需的稳定pH范围内，有利于问题的研究。
注意问题：⑴考虑缓冲液的缓冲范围⑵选用缓冲对时，考虑缓冲液是否会对反应造成影响，比如会不会成为反应的反应物或产物。
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