Northern blot

Northern blot

1. 将总RNA转移到尼龙膜上：

试剂：

溶液 DEPC H2O 成分 DEPC (焦炭酸二乙酯) H2O 10×MOPS 200mM MOPS- NaOH 50mM NaAC 10mM EDTA pH7.0 配方 H2O中加入0.1% DEPC→ 混匀→ 37℃放置12h→ 121℃灭菌40min DEPC 160ml MOPS 8.372g 1M 10ml 0.5M EDTA 4ml 用2M NaOH调pH至7.0，DEPC H2O定容到200ml， 灭菌。 RNA 甲醛变性胶loading buffer 1×MOPS 17%甲醛 50% 去离子甲酰胺 0.01%溴酚蓝 10%甘油 10×MOPS 50ul 甲83ul 50% 去离子甲酰胺 250ul 溴0.01% 甘50ul DEPC H2O 67ml 20×SSC 3M NaCl 0.3M 柠檬酸钠 pH7.0 800ml H2O +175.3g NaCl + 88.2g柠檬酸钠→ 用NaOH调pH至7.0→ 定容到1L→ 0.1% DEPC处理→ 121℃灭菌40min 油 酚蓝 醛 NaAC H2O

1

步骤：

1) 电泳槽、胶板及梳子先用0.2M NaOH+0.1%SDS浸泡，再用水冲洗干净，最后用

DEPC H2O 淋洗。用到的玻璃器皿、刀片等要180℃烘烤6h。枪头、离心管和滤纸等要121℃灭菌40min。

2) 配1.2%甲醛变性琼脂糖凝胶100 ml。称1.2 g琼脂糖，加73 ml DEPC处理的

双蒸水，溶解后稍冷却，加入10 ml 10×MOPS，冷至70℃时加17 ml 甲醛，混匀， 然后倒入胶槽中。

3) 用30ul RNA 甲醛变性胶loading buffer溶解RNA，然后65℃保温10min，立

即放到冰上。

4) 用DEPC H2O稀释10×MOPS为1×，作为电泳缓冲液，样品冷却后上样。恒压

60V电泳3－4小时，电泳槽周围加冰。

5) 溴酚兰距胶板边缘2 cm左右时停止电泳。切掉加样孔及多余的胶，切掉左下

角作标记。

6) 凝胶在20×SSC中平衡2×15 min。

7) RNA的毛细转移：大平皿中盛20×SSC，凝胶放在滤纸桥上，其上覆盖尼龙

膜，膜上放滤纸及10厘米厚的纸巾，上压500克重物。 毛细转移24小时后，80℃真空烤膜2小时。

2. 杂交:

探针 RNA DNA 使用浓度 100ng/ml 5-25ng/ml 杂交液 标准杂交液＋50%甲酰胺 高SDS杂交液 杂交温度 68℃ 50℃ *RNA探针灵敏度高于DNA探针。 *DNA探针标记，及试剂母液的配方见Southern 杂交。

1) 标准杂交液：

5×SSC

1%（W/V）Blocking Reagent （Roche 公司产品） 0.1%（W/V）十二烷基肌氨酸钠 0.02% SDS

2

2)高SDS杂交液：

7% SDS 5×SSC

50% 去离子甲酰胺

2%（W/V）Blocking Reagent （Roche 公司产品） 0.1%（W/V）十二烷基肌氨酸钠 50 mM 磷酸纳缓冲液， pH 7.0 配方：

SDS 7g 30×SSC 16.6ml 去离子甲酰胺 50ml 10×BR 20ml 2%（W/V）十二烷基肌氨酸钠 5ml 1M 磷酸纳缓冲液， pH 7.0 5ml DEPC H2O定容至100ml, -20℃储存

1）将膜浸入10 ml 高SDS杂交液中，50℃ 60 rpm预杂交至少1h。

2) 倒掉预杂交液，将DNA探针在100℃变性10 min后，立即放到冰上，冷却2min后 加入10 ml杂交液中，然后倒入杂交瓶中，50℃ 60 rpm杂交12－16小时。 3) 杂交结束，回收杂交液，－20℃可保存1年，再用时65℃加热10min。

3. 洗膜及检测：见Southern 杂交

3