明胶酶谱实验方法

明胶酶谱实验

72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）

抽提缓冲液：

10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L CaCl2, 1μmol/L ZnSO4, 0.01% (v/v) Triton X-100, （0.5% PMSF）。

10mmol/LPMSF 溶液：取 PMSF 粉末 17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。

注意： PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。

先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了

明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。你加了这个我保证你一辈子也做不出来。

蛋白浓度一般是先摸索一个量。就是分别上 10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug 跑一下 电泳，先看结果。条带看不见的，或者太透明的，都不能选。就是要半明半暗的那种。看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。

(1)、 5%浓缩胶 (现配现用)：

d3H2O 2.1ml 30%丙烯酰胺溶液 0.5ml 1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml 10% SDS 30μl 10%过硫酸铵(AP) 30μl TEMED 3μl 3ml (2)、 10%分离胶 (现配现用)：

d3H2O 2.1ml 30%丙烯酰胺溶液 2.31ml 1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml 10% SDS 70μl 10%过硫酸铵(AP) 70μl TEMED 5.6μl 1%明胶 0.7ml

7ml

(3)、 4×上样缓冲液（4oC保存）：

0.32% Tris-HCL 6.4ml

4%SDS 8ml 50%甘油 3.2 ml 溴酚蓝 0.024g d3H2O 2.4ml

20ml

① wash buffer Ⅰ 500ml

50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 5 mM CaCl2 （110.99） 0.2776g 1μM ZnCl2 （136.30） 0.068mg 2.5% Triton X-100 12.5ml ② wash buffer Ⅱ 500ml

50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 5 mM CaCl2 （110.99） 0.2776g 1μM ZnCl2 （136.30） 0.068mg ③ incubate buffer 500ml

50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 50mM CaCl2 （110.99） 0.2776g 1μM ZnCl2 （136.30） 0.068mg 1% Triton X-100 5.0ml

（五） 注意事项

1）孵育时间可以根据情况而定，可以延长。 2）明胶应该现用现配。 3）用血清上样作为阳性对照。

明胶酶谱相关溶液及试剂的配制 (4)、 5%浓缩胶 (现配现用)：

d3H2O 2.1ml 30%丙烯酰胺溶液 0.5ml 1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml 10% SDS 30μl 10%过硫酸铵(AP) 30μl TEMED 3μl 3ml (5)、 10%分离胶 (现配现用)：

d3H2O 2.1ml 30%丙烯酰胺溶液 2.31ml 1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml 10% SDS 70μl 10%过硫酸铵(AP) 70μl TEMED 5.6μl 1%明胶 0.7ml

7ml

(6)、 4×上样缓冲液（4oC保存）：

0.32% Tris-HCL 6.4ml

4%SDS 8ml 50%甘油 3.2 ml 溴酚蓝 0.024g d3H2O 2.4ml

20ml

(7)、 5×Tris-甘氨酸电极缓冲液：三蒸水配制，其中含0.125mol/LTris-HCL、

1.25mol/L甘氨酸和0.5%SDS，完全溶解后调pH至8.3，室温保存，用时稀释5倍。