第1课时 目的基因的获得、基因表达载体的构建
[目标导读] 1.阅读教材P72～74图文，掌握获取目的基因的两种方法。2.结合教材P77图4－11，理解基因表达载体的构建过程。
[重难点击] 1.目的基因的含义及常用获取方法。2.基因表达载体的构建。3.大肠杆菌质粒DNA的提取。
抑制疾病传播的转基因蚊子巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫，能够传播脑炎、丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐。为了抑制疾病的传播，巴西科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊。科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具该基因的转基因雄蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而减少了该种蚊子的数量，达到抑制疾病传播的目的。怎样才能最终得到转基因雄蚊呢？让我们一起来学习基因工程的基本操作程序吧！
一、目的基因的获得
1．目的基因：是指人们所需要的进行研究的基因，如抗虫基因、抗病基因等。 2．获取目的基因的方法 (1)化学合成法
①概念：利用化学反应直接合成基因。
②适用条件：已知核苷酸序列的、相对分子质量较小的目的基因。 ③仪器：DNA自动合成仪。
④缺点：成本昂贵，不适用于序列未知的目的基因。 (2)从基因组中直接分离法——鸟枪法(如图所示)
(3)PCR扩增：在掌握了目的基因的部分或全部信息后，可以设计引物，利用DNA扩增仪(PCR仪)直接扩增目的基因。 (4)反转录法
以mRNA为模板，借助反转录酶，通过PCR仪合成与mRNA序列互补的DNA片段，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的目的基因。
如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。据图分析：
1．图示分别是哪种方法？是在体内还是体外进行的？
答案 三种方法分别是：反转录法、直接分离法和化学合成法，都是在体外进行的。 2．三种方法都需要酶，分别是哪些酶？
答案 方法a需要反转录酶和DNA聚合酶；方法b需要限制性内切酶；方法c需要DNA聚合酶。
3．三种方法获取的目的基因的碱基对的排列顺序都相同吗？
答案 不都相同。方法b得到的是天然基因，方法a得到的目的基因和天然基因相比不含内含子，方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种。
1．下列获得目的基因的方法中需要模板链的是( ) ①化学合成法 ②鸟枪法 ③反转录法 ④PCR扩增目的基因 A．①② B．②③ C．③④ D．①③ 答案 C
解析 化学合成法是利用DNA自动合成仪合成已知核苷酸序列的较小的基因。鸟枪法是用很多个限制性内切酶去切割DNA获得目的基因，和化学合成法一样不需要模板。反转录法利用mRNA作为模板反转录出一条单链DNA，然后以这条单链的DNA为模板合成出双链的DNA，也是目的基因。PCR技术也需要模板。 2．下列属于PCR技术的条件的是( )
①单链的脱氧核糖核苷酸序列引物 ②目的基因所在的DNA片段 ③脱氧核糖核苷酸 ④核糖核苷酸 ⑤DNA连接酶 ⑥DNA聚合酶 ⑦限制性内切酶 A．①②③⑤ C．①②③⑤⑦ 答案 B
解析 PCR技术需要一对引物，即一对单链的脱氧核糖核苷酸序列引物，①正确；PCR技术需要模板，即目的基因所在的DNA片段，②正确；需要脱氧核糖核苷酸作为原料，③正确；核糖核苷酸是合成RNA的原料，而PCR合成的是DNA，④错误；采用PCR合成DNA时，不需要DNA连接酶，而需要DNA聚合酶，⑤错误、⑥正确；体外合成DNA时，不需要限制性内切酶，⑦错误。
知识拓展 PCR技术的基本原理和过程 (1)原理：DNA双链复制。
(2)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。 (3)过程
第一步：加热至94～98 ℃，DNA解链为单链； 第二步：冷却至40～60 ℃，引物结合到互补DNA链；
第三步：加热至72 ℃左右，热稳定DNA聚合酶(TaqDNA酶)从引物起始进行互补链的合成。 如此重复循环多次。
(4)结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2，n为扩增循环的次数)。
n
B．①②③⑥ D．①②④⑤⑦
二、基因表达载体的构建
1．实验：大肠杆菌质粒DNA的提取 (1)实验原理
NaOHKAc中和??染色体DNA――→变性沉淀――→不复性SDS
菌体――→释放?NaOHNaOHKAc中和?―→变性沉淀――→复性?质粒DNA―
?上清液：质粒DNA离心?――→?
?沉淀：染色体DNA?
(2)方法步骤
①在超净工作台上(或在酒精灯旁)，取1 mL含质粒的大肠杆菌菌液，接种于100 mL LB培养基中，于37 ℃摇床振荡培养8～10 h，如无摇床可每0.5 h用手摇晃一次。 ②取1.4 mL菌液于1.5 mL EP管中，以10 000 rpm离心0.5 min，弃上清液。 ③加0.1 mL预冷的溶液Ⅰ，充分混合。
④加入0.2 mL溶液Ⅱ轻轻翻转混匀，静置5 min(溶液Ⅱ要现配现用)。 ⑤再加入0.15 mL预冷溶液Ⅲ，轻轻翻转混匀，静置5 min。 ⑥以10 000 rpm离心20 min，取上清液于另一新EP管中。
⑦加入等体积预冷的异丙醇或乙醇，混匀后静置于冰箱的冷冻室20～30 min。 ⑧10 000 rpm离心15 min，弃上清液。待沉淀稍干后，溶于50 μL蒸馏水中。
⑨取两支试管，分别加入1 mL蒸馏水，其中的一支加入提取的质粒DNA溶液，向两支试管中各加入1 mL二苯胺，混匀后，放入沸水中加热5 min。
⑩待试管冷却后，观察两支试管中溶液颜色的变化发现，加入提取的质粒DNA的溶液变蓝，另一个不变色。 2．基因表达载体的构建 (1)构建基因表达载体的原因
①单个基因或DNA片段导入另一生物体的细胞后，往往会被细胞内的防御系统消灭掉，降低了目的基因的表达效率。
②将目的基因和运载体一起进入受体细胞，可以保护目的基因不被受体细胞识别并破坏。 (2)构建过程
①用限制性内切酶切割质粒，使环状质粒出现一个切口，露出DNA末端。 ②用同样的限制性内切酶切割目的基因，暴露出两个与质粒相同的DNA末端。 ③用DNA连接酶使质粒和目的基因结合成新的环状质粒DNA分子表达载体。
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