DNAstar：序列拼接 MEGA：分析碱基组成 CLUSTAL：序列比对 PAUP：跑树 DABE：饱和性分析
总思路：序列拼接-比对-
四、下载序列的方法
打开.Fasta格式的序列-File export-sequance alignment-保存 在NCBI上找到相应的序列方法：
Search Nucleotide for 文章的genibank序列号-reports-复制序列到txt文件中，删除没用的东西，只留下序列和学名。 保存成txt文件后，打开Editseq-将,txt序列复制到其中-save保存为seq格式
五、将拼接序列翻译成蛋白质方法
打开拼接的序列-全选中-Goodies-translate DNA 2、如何计算碱基含量比值、 答：MEGA-Nucleotide Composition
六、DAMBE序列饱和性分析
序列的饱和性分析在DAMBE程序中，以转换、颠换数为纵轴，以TN93模型（Tamura and Nei, 1993）校正的距离为横轴做散点图。如果这些点随序列间分歧增大呈线性分布就说明序列间替换没有达到饱和，序列可以用于后续的系统发育分析。DAMBE还长用在单倍型的归纳、基因频率和碱基组成分析、遗传距离计算、序列排序、
5.2.2碱基替换饱和效应的检验
当核苷酸序列分歧较小时，序列之间被观察到的核苷酸差异数接近实际替换数。如果序列分歧较大，DNA序列的变异可能会受到饱和效应的影响，这时观察到的碱基差异可能包含了部分进化杂音。一般说来，碱基转换发生的频率高于颠换，但是随物种分歧程度的增加，转换/颠换的比率接近或小于1，说明转换可能已经趋于饱和并可能成为进化杂音，所以转换和颠换发生的频率与序列间分歧度的关系就可以反映出碱基替换是否受饱和效应的影响。在着手构建分子系统树前，为了排除这种进化杂音获取正确的进化信息，必须对目的片段的碱基替换是否受到饱和效应的影响进行检验。
用 DAMBE（Xia，2000）分别对四个mtDNA片段的碱基替换模式进行检测，以此估计所研究mtDNA片段的碱基替换是否受到饱和效应的影响。
打开DAMBE-FILE-Open standard sequence file-类型unknown-打开
proteincoding
and
nuc.seq-invMtdna-trains-table
versis
advance
–go-graphics-trainsition tranversion
–tn93-g0-graphstyle-curve only-保存.bmp
问题
1、如何计算密码子的不同位上碱基变化，转换颠换比值 2、如何进行序列的饱和性分析
序列的饱和性分析在DAMBE程序中，以转换、颠换数为纵轴，以TN93模型（Tamura & Nei, 1993）校正的距离为横轴做散点图。如果这些点随序列间分歧增大呈线性分布就说明序列间替换没有达到饱和，序列可以用于后续的系统发育分析。
3、如何看用Editseq检验拼接后的序列是否能正确翻译为蛋白质 4、如何计算遗传距离（DAMBE）
一、DNAstar：序列拼接
在序列的拼接时，修改红色和小写字母的碱基 具体步骤：
1、 2、
ABI文件包括图形和序列、SEQ文件只有序列没有图。 DNAstar—seqman—File—NEW，把序列都放近去，有两
个正向，俩个反向的序列—Time ends—LOW—SEAN ALL-ASSEMBLE –出现contig 打开-双击contig_@_核对-contig-save consenus-single file -保存位置-sequce-add-选择保存到的位置-点序列名字-add-双击-拼接完关闭。 3、 4、 5、
原始序列和拼接的序列各保存在一个文件夹内。 EDIT-GOODIES-TRALS 翻译成蛋白质。‘
从ncbi上下载相关的序列和测得的序列保存在一个文件
夹内，把前面的内容都删除，保留种名。加〉符号-保存
二、序列的比对
6、
先切齐序列：用Seqman-sequence-add-skip-把所有的序列加进去进行删除，使序列整齐。-contig双击,将序列切齐，再复制到一个新建的文本文档。 7、
切齐后保存方式：contig-export sequences-multiple files=set
location-file-保存切齐 8、
当在切齐的序列中发现反向序列要改正：用editseq打开序
列-select all –goodies-reserse complement-全选粘贴到文本文档中，目的是比对。
三、构建NJ树方法(MEGA)
1、将TXT格式保存为nexus和clustal格式（生成aln\\dnd\\nxs）
CLUSTAR-进行比对-FILE-LOAD SEQUENCE-打开新建的文本文档
txt-加入进去后-aligment-do complete
Alignment-File-Save sequence as –format-custal-ok-File- Save sequence as –format-NEXUS最后保存为nexus和clustal格式，NEXUS是PAUP格式-关闭clustal.
2、点击
MEGA-File-open data-.aln文件-打开-ok-点击向下的绿色图标
MEGA-File-open data-切齐序列,meg-ok-yes-inverttebrate
-ok-ok-删除最后没用的东西-保存-切齐序列,meg- 3、点击
Mitochondrial-ok-
4、phylogency-construct phylogency - NJ树-none改成bootstrap-k 2p-compute-保存（image-EMF）
5、使用Mega 2.0分析序列间的p-distance, 即两两序列间的核酸差异比例，分析序列变异情况 方法1：
Distance-compute pairwise-distance only改为std err-compute 方法2：
pattern-compute composition distance
三、构建MP树方法
1、MrBays，目的是转化为.nex文件步骤为：
用bioedit将.txt文件比对转换成.nex文件格式
方法：打开BioEdit，将.txt文件打开-Accessory application-clustal multiple alignment-File-export-sequence Aligment-选paup/nex命令.nex-保存-把.nex begin 前面的都删除。
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