RNA提取 休眠 碳水化合物 基因表达 SSH论文

RNA提取论文：自然休眠期油桃花芽碳水化合物变化规律及相关基因的表达分析

【中文摘要】本研究以十年生露天和三年生盆栽‘曙光’油桃(Prunus persica var. nectarine cv. Shuguang.)花芽为试材,主要研究了桃树花芽RNA提取、碳水化合物代谢及其相关基因的季节性表达及低温处理下相关基因的表达变化;利用抑制差减杂交技术(SSH),以休眠期花芽RNA为Tester,以休眠解除期花芽RNA为Driver,构建花芽休眠相关基因的差减cDNA文库。主要结论如下:1、经改良CTAB法提取的油桃花芽RNA,电泳检测条带清晰,28S与18S亮度比约为2:1,说明RNA完整性较好;核酸分光光度计检测A_(260)/A_(280)为2.0左右,说明无蛋白等杂质残留,能满足基因表达分析等后续试验的要求;而Trizol试剂盒法所提取的RNA,几乎检测不到条带,难以达到进一步试验的要求。2、休眠期间可溶性糖(主要是蔗糖)含量尤其是在内休眠后期显著增加,淀粉含量则呈相反趋势,在内休眠后期含量降低,预示着内休眠的结束;葡萄糖和果糖含量稍有降低,变化不大;糖代谢相关基因AGPase、HisH3、HK1、SuSy、UGPase表达明显不同:AGPase无明显变化;HisH3和HK...

【英文摘要】RNA extraction of nectarine floral buds and the seasonal expression of carbohydrate metabolism and related genes were examined using ten-year-old field-grown‘Shuguang’nectarine; the expression of related genes under low

temperature treatment were detected using three-year-old potted‘Shuguang’nectarine. A subtractive cDNA library was developed to study genes associated with the dormant floral buds in nectarine by using the RNA from dormant floral buds as“tester”and that from burst floral buds as“driver”. The...

【关键词】RNA提取 休眠 碳水化合物 基因表达 SSH

【英文关键词】RNA extraction dormancy carbohydrate gene expression SSH

【目录】自然休眠期油桃花芽碳水化合物变化规律及相关基因的表达分析10-11概述13-23

符号缩写及中英文对照4-10Abstract11-12

摘要

1.1 休眠1.1.1.1

1 引言13-39

1.1.1 休眠的进程与分类13-15

1.1.1.2 休眠的分类

休眠的研究进程13-1414-15

1.1.2 休眠机理研究进程15-18

1.1.2.2 休眠的解除

17-18

1.1.2.1 休眠1.1.3 芽休1.1.3.2

的诱导15-17眠研究18-23呼吸代谢途径学说20-21

1.1.3.1 激素调节学说18-1919-20

1.1.3.3 光系统控制学说

21-22

1.1.3.4 代谢物的调节学说1.1.3.5 基

因表达学说22-2323-27

1.2 碳水化合物及其相关基因的研究

1.2.2

1.2.1 碳水化合物及其代谢概述23-24

碳水化合物代谢相关酶24-26研究26-27

1.2.3 休眠过程中碳水化合物

27-30

1.3.1 CTAB

1.3 木本植物RNA 提取

法27-2828

1.3.2 热硼酸法281.3.3 异硫氰酸胍法1.4 植物体内差异表达基因

1.4.2

1.3.4 试剂盒法28-30

的筛选30-331.4.1 mRNA 差异显示技术30-31

RNA 随机引物聚合酶链式反应3131-32杂交32法-SSH33-38术体系评价34应用34-3836

1.4.3 代表性差示分析

32

1.4.5 抑制消减1.5 本研究所用方

1.5.2 SSH 技

1.4.4 基因表达的序列分析1.4.6 基因芯片技术32-33

1.5.1 SSH 技术流程

33-34

1.5.3 SSH 技术在分离植物差异表达基因中的1.5.3.1 应用SSH 技术分离组织特异性表达基因

1.5.3.2 应用SSH 技术分离与次生代谢物合成相关的特异

1.5.3.3 应用SSH 技术分离与诱导型表达有37-38

1.5.3.3.1 生物胁迫诱导的差异基

表达基因36-37关的抗性相关基因因研究37-383839-5439-42提取40-41

1.5.3.3.2 非生物胁迫诱导的差异基因研究

2 材料与方法2.2 测定方法39-4040-41

2.2.2 RNA 2.2.2.2

1.6 研究目的与意义38-392.1 实验材料与处理392.2.1 自然休眠进程的确定

2.2.2.1 改良CTAB 法

Trizol 试剂盒法4141

2.2.3 荧光定量表达分析

2.3 抑制差减杂交2.3.2 去除基因2.3.4 cDNA 差减

2.2.4 碳水化合物的测定41-42

2.3.1 总RNA 提取42-432.3.3 mRNA 的纯化43-44

技术42-53组DNA43

文库构建44-532.3.4.1 cDNA 第一链的合成

44-45酶切45-46轮杂交48

2.3.4.2 cDNA 第二链的合成45

2.3.4.4 接头的连接46-482.3.4.6 第二轮杂交

48-49

2.3.4.3 RsaⅠ2.3.4.5 第一2.3.4.7 第一次

PCR 反应49-5050-5151-52

2.3.4.8 第二次PCR 反应

2.3.4.9 应用T/A 克隆法构建正反向差减文库2.3.4.9.1 PCR 反应产物的纯化51

2.3.4.9.2

差减cDNA 片段与pEASYTM-T3 Cloning（TransGen Biotech）载体连接51-52

2.3.4.9.3 连接产物的转化52

2.3.4.9.4 差

减cDNA 文库的构建5252-5354-62检测54-5555-5656-5757-58取RNA58测58-59

2.3.4.10 DNA 测序和序列分析

3 结果与分析

3.2 RNA 质量

2.4 数据处理53-54

3.1 桃芽自然休眠进程的确定54

3.3 休眠期间碳水化合物含量变化

3.4 与碳水化合物代谢有关的基因的表达变化3.5 低温条件下有关基因的转录表达变化3.6 SSH 结果分析58-62

3.6.1 改良CTAB 法提

3.6.2 双链cDNA(dscDNA)合成与RsaⅠ酶切效率检3.6.3 两次PCR 产物分析

59-60

3.6.4 差减

文库的构建及阳性克隆的筛选6060-6262

4 讨论

62-66

3.6.5 测序及功能分类

4.1 桃树花芽总RNA 的提取

4.3 与碳

4.2 休眠期间碳水化合物含量变化62-63

63-64

水化合物代谢有关的基因的含量变化筛选及分析64-66

4.4 cDNA 文库的参考文献

5 结论66-67

67-8687-88

致谢86-87攻读学位期间发表的学术论文

硕士学位论文内容简介及自评88