实验一 微生物的认识（4学时）
一、实验目的
1、掌握显微镜的使用和保养方法
2、了解显微镜的基本原理和细菌形态 3、建立无菌概念 二、实验内容
1、学习显微镜的使用和保养 2、观察细菌的染色装片 3、微生物检查
三、显微镜的结构和使用保养 （一）显微镜的构造
普通光学显微镜机械系统和光学系统两部分组成。 1、显微镜的机械系统
（1）镜座 镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。 （2）镜筒 镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。 （3）物镜转换器
Motic显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。 （4）载物台 载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。 （5）推进器 是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。 （6）粗调螺旋 粗动螺旋是移动载物台调节接物镜和标本间距离的机件，右手向前扭载物台下降，让标本远离物镜，反之则上升，标本接近物镜。
（7）微调螺旋 用粗调螺旋只可以粗放的调节焦距，要得到最清晰的物象，需要用微调螺旋做进一步调节。微调螺旋每转一圈镜筒移动0.1毫米（100微米）。 2、显微镜的光学系统
（1）集光镜 卤素灯泡（12V/20W），配有电流调节螺旋通过，调节电流大小调节光照强度。
（2）聚光器 由阿贝聚光透镜（数值孔径1.25）、虹彩光圈和升降螺旋组成的。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于0.6时会显示出色差和球差。
聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最强的照明，使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被检物体上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦点在其上方1.25mm处，而其上升限度为载物台平面下方0.1mm。因此，要求使用的载玻片厚度应在0.8—1.2mm之间，否则被检样品不在焦点上，影响镜检效果。聚光器前透镜组
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前面还装有虹彩光圈，它可以开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑；若收缩虹彩光圈过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过虹彩光圈的调节再把视场光阑（带有视场光阑的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在视场内的物体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。
（3）物镜 安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像，物镜成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径（numerical apeature简写为NA），每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。
物镜的种类很多，可从不同角度来分类：
根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：
①干燥系物镜 以空气为介质，如常用的40×以下的物镜，数值孔径均小于1。
②油浸系物镜 常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜，其放大率为90×—100×，数值孔值大于1。
根据物镜放大率的高低，可分为：
①低倍物镜 4×/0.1， 物镜视场：4.5mm； ②中倍物镜 10×/0.25； 物镜视场：1.8mm； ③高倍物镜 40×/0.65； 物镜视场：0.45mm； ④油浸物镜 100×/1.25 物镜视场：0.18mm； 根据物镜像差校正的程度来分类可分为：
①消色差物镜 是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，该物镜可以除红光和青光形成的色差。镜检时通常与惠更斯目镜配合使用。
②平场物镜(Plan)。
（4）目镜10/18（后一数字表示视场数）目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”，物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面处，所以其上可安置目镜测微尺。
物镜视场 ＝ 视场数/物镜的放大倍数 （二）显微镜的性能
显微镜分辨能力首先取决于物镜的性能，其次为目镜和聚光镜的性能。 1、数值孔径 也叫做镜口率（或开口率），简写为N.A，在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径，数值孔径是物镜和聚光器的主要参数，也是判断它们性能的最重要指标。数值孔径和显微镜的各种性能有密切的关系，它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比，与镜象亮度的平方根成正比。
数值孔径可用下式表示： α
N.A=n.sin 2
式中：
n—物镜与标本之间的介质析射率 α—物镜的镜口角
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所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度。镜口角α总是小于180°。因为空气的折射率为1，所以干燥物镜的数值孔径总是小于1。
几种物质的介质的折射率如下：
空气为1.0，水为1.33，玻璃为1.5，甘油为1.47，香柏油为1.52。 2、分辨力
D可用下式表示： D=λ/2N.A.
可见光的波长为0.4—0.7微米，平均波长为0.55微米。若用数值孔为0.65的物镜，则D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。这表示被检物体在0.42微米以上时可被观察到，若小于0.42微米就不能视见。如果使用数值孔径为1.25的物镜，则D=2.20微米。凡被检物体长度大于这个数值，均能视见。由此可见，D值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根据上式，可通过：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高分辨力。紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。物镜分辨力的高低与造象是否清楚有密切的关系。目镜没有这种性能。目镜只放大物镜所造的象。 3、放大率：
显微镜放大物体，首先经过物镜第一次放大造象，目镜在明视距离造成第二次放大象。放大率就是最后的象和原物体两者体积大小之比例。因此，显微镜的放大率（V）等于物镜放大率（V1）和目镜放大率（V2）的乘积，即：
V=V1×V2 4、焦深：
在显微镜下观察一个标本时，焦点对在某一象面时，物象最清晰，这象面为目的面。在视野内除目的面外，还能在目的面的上面和下面看见模糊的物象，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和数值孔径及放大率成反比：即数值孔径和放大率愈大，焦深愈小。因此调节油镜比调节低倍镜要更加仔细，否则容易使物象滑过而找不到。
(三) 显微镜的使用操作及注意事项 1、观察前的准备
显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约5cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。 2、低倍镜观察 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。
将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒（或下降载物台），直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。
3、高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台
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上升（或镜筒下降），直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察。 4、油镜观察 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。
使用油镜按下列步骤操作：
1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出，4倍物镜对准光路。
2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。
3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。
4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。
5、观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2—3下即可，（注意向一个方向擦拭）。 6、将各部分还原，转动物镜转换器，4倍物镜对准光路，载物台下降至最低，降下聚光器，用柔软纱布清洁载物台等机械部分，整理电源线，罩上显微镜罩，然后将显微镜放回。 四、细菌染色装片观察
1、观察顺序：低倍镜→（中央）高倍镜（中央）→油镜 2、绘图
（1）油镜下观察到的图像；
（2）在图像下注明菌种名称，后面括号内注明放大倍数。 五、微生物检查
1、实验室空气：打开培养皿盖，暴露1小时。37°C倒置培养2天后观察。 2、人体表面
（1）手指表面：火焰旁用手指在培养基表面轻按一下。37°C培养2天后观察。 （2）头发：在培养基上放置1-2跟头发。37°C培养2天后观察。
六、实验报告要求（略）
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