33.简述E．coli核苷酸切除修复机制。答：E．coli的核苷酸切除
修复主要由四种蛋白组成：UvrA、UvrB、UvrC、UvrD。两个UvrA分子和一个UvrB分子组成复合物结合于DNA，并消耗ATP沿着DNA链移动，UvrA能够发现损伤造成的DNA双螺旋变形，由UvrB负责解链，在损伤部位形成单链区，并使之弯曲约130度，接着UvrB募集内切核酸酶UvrC，在损伤部位的两侧切断DNA链，其中一个切点位于损伤部位5’侧八个核苷酸处，而另一个切点位于3’侧四或五个核苷酸处。然后，DNA解旋酶UvrD去除两切口之间的DNA片段，由DNA聚合酶和连接酶填补缺口。
34.简述人类核苷酸切除修复机制。答：人XPC蛋白负责发现DNA双
螺旋中的变形，其功能相当于E．coli中的UvrA；人XPB和XPD蛋白具有解旋酶活性，其功能相当于E．coli中的UvrB；核酸酶ERCCl-XPF切割损伤部位5’侧，X．PG切割3’侧，其功能相当于uvrC高等生物NER切割单链DNA片段程度为24—32个核苷酸。这一片段被释放后，产生的缺口由DNA聚合酶和连接酶填补。NER不仅能够修复整个基因组的损伤，而且能够拯救因转录模板链损伤而暂停转录的RNA聚合酶，即转录偶联修复。在这一过程中，NER蛋白被募集于暂停的RNA聚合酶。
35.简述人全基因组与转录偶联核苷酸切除修复过程中的异
同点。答：人全基因组与转录偶联核苷酸切除修复的基本过程相同，即都
有发现错误，解链并募集内切核酸酶，切割损伤部位，解旋去除损伤位点，DNA聚合酶和连接酶填补缺口。转录偶联与全基因组核苷酸切除修复的不同点在于hER蛋白被募集于暂停的RNA聚合酶，并且转录偶联修复的核心TFⅡH分别参与了两个独立过程：一是在核苷酸切除修复时起DNA解旋酶的作用；二是在转录过程中打开DNA模板。
36.简述大肠埃希菌重组修复机制。答：E-coli的rec基因编码的几
种酶(recA、recB、reeC和recD)参与重组修复。recB、recC、recD酶复合物兼有解旋酶和核酸酶活性，它利用ATP水解提供能量沿着DNA移动。其中，recB和recD是两种解旋酶，recB沿DNA链5’端解旋，运动速度较慢；而recD沿DNA链3’端解旋，运动速度较快，导致单链DNA环状结构逐渐累积。当recB、reeC、recD遇到chi序列。5’-GCTGGTCC-3’时，它就在附近将单链DNA切断，从而使DNA重组成为可能。E．coli的recA蛋白在DNA重组中起关键作用。recA蛋白紧紧结合于单链DNA，每圈结合六个recA分子。DNA单链区产生于recB、recC、recD酶的作用或DNA缺口。recA蛋白结合DNA具有正协同效应。E．coli的RuvA蛋白识别Holliday结构连接处，而RuvB蛋白具有解旋酶和ATPase活性，能驱动分支移动。最后由内切核酸酶RuvC特异识别Holliday结构中的ATrG序列并切割DNA，使Holliday结构分离，从而完成DNA重组。
37.人DNA双链断裂后的修复机制。答：对于DNA双链断裂损伤，
细胞必须利用双链断裂修复，即重缉修复，重组修复分为同源重组和非同源末端连接。DNA双链断裂后，细胞中存在姐妹染色体时，则通过同源重组的方式进行修复，如细胞中不存在姐妹染色体时，则通过非同源末端连接的方式进行修复。
38.简述SOS修复机制。答：在DNA受到严重损伤时，SOS应答能够诱导
合成很多参与DNA损伤修复的酶和蛋白质。SOS应答十分迅速，在DNA损伤发生后几分钟内就可出现。转录阻遏蛋白Lex．A抑制若干编码参与SOS应答蛋白质的基因表达，具有潜在的蛋白水解酶活性，E coli的DNA损伤产生的单链DNA诱导recA蛋白水平提高近50倍，而recA．蛋白能激活LexA自我蛋白酶解，导致至少15个参与SOS应答的损伤修复蛋白基因解除阻遏状
态而表达。recA激活的靶蛋白断裂位点是位于多肽链中央的二肽Ala-Gly。Ecoli的recA蛋白有双重功能，一是在DNA重组过程中具有DNA链交换活性；二是具有蛋白水解酶激活活性。当DNA两条链的损伤邻近时，损伤不能被切除或重组修复，这时在内切核酸酶、外切核酸酶的作用下造成损伤处的DNA链空缺，再由损伤诱导产生的一整套特殊DNA聚合酶即SOS修复酶类，催化空缺部位DNA的合成，这时补上去的核替酸几乎是随机的，但仍然保持了DNA双链的完整性，使细胞得以生存。这种修复带给细胞很高的突变率。
39.简述Sanger DNA测序法的原理。答：Sanger DNA测序法是建
立在两个基本原理之上：(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5’端向3’端聚合；(2)可延伸的引物必须能提供游离的3’羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3’羟基末端，因此会终止聚合反应的进行a如果分别用4种双脱氧核苷酸终止反应，则会获得4组长度不同的DNA片段。通过比较所有DNA片段的长度可以得知核苷酸的序列。
40.何谓PCR?试述PCR技术的基本原理和影响茵素。答：PCR
是一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术，其原理类似DNA的体内扩增a它包括：PCR包括三个基本过程：①变性，即在较高温度(93℃～98％)使双链模板DNA变性解链成单链DNA，以提供复制的模板；②退火，即在较低温度(37℃～65％)使加入的引物与待扩增DNA区域特异性地结合，以提供DNA复制起始的3’-OH；③延伸，即在适当的温度(70qC～75℃)下，DNA聚合酶从特异性结合到DNA模板上的引物3’一OH端开始，根据碱基互补配对原则，按照待扩增区域的核苷酸序列， 进行DNA链的延伸，即合成新的DNA分子。这三个过程组成一个循环周期；每个周期合成的产物又可作为下—个周期的模板，如此循环往复，经过11轮循环后，靶DNA的拷贝数理论n2=上呈2增长。影响PCR反应的因素主要有：引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、模板和Mg离子，此外，pH、温度、循环次数也会影响PCR反应。
41.PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样
的信息? 答：PCR是根据DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。用PCR扩增某一基因至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。
42.切口平移(nick translation)标记探针的主要步骤有哪些?
答：(1)DNase I造成切口；(2)DNA聚合酶Ⅲ的5’-3’外切核酸酶进行切割；(3)DNA聚合酶Ⅲ的5’-3’合成酶进行修补；(4)在修补过程中，随着切口(nick)的移动，将放射性的底物掺人到双链DNA中。
43.什么是Western免疫印迹?它与Southern印迹有什么不
同? 答：Western免疫印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支
持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它Southern的不同在于探针的性质不同，在Western免疫印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。
44.什么是随机引物(random primer)?如何标记DNA?答：随
机引物是人工合成的长度为6个核苷酸的寡聚核苷酸片段群体，含有各种可能的排列顺序(46=4096)；或是用DNase处理、牛胸腺DNA后获得的6-12个碱基的片段。将待标记的DNA片段同随机引物一起进行杂交，并以杂交体上的寡聚核苷酸为引物，在ICdenow酶的作用下合成互补DNA链，当反应底物中有放射性的dNTP时，新合成的DNA就带上了标记。
45.什么是印迹(blotting)杂交?答：通过一定的物理学方法将DNA、RN
A或蛋白质从凝胶上转移到固体支持物，然后同液体中的探针(抗体)进行杂交，以检测特异DNA、RNA或蛋白质的一种方法。因为DNA、RNA或蛋白质从凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故此将这种杂交称为印迹杂交。
46.什么是原位菌落杂交(colony，hybridization)?答：原位菌
落杂交是根据微孔滤膜杂交和原位杂交的原理而改良的一种筛选重组体的
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