微生物学实验指导

实验三 细菌的简单染色及形态观察

一、实验目的

1.学习微生物涂片、染色的基本技术。 2.掌握细菌的简单染色法。 3.初步认识细菌的形态特征。 二、实验原理

细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞非常小，又因为其含水量高

（一般在80％～90％以上），对光线的吸收和反射与水溶液差别不大，与周围背景没有明显的明暗差，所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算活菌外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察，但不能辨别其构造。 染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于载玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态，防止细胞膨胀或收缩。 三、实验材料

1.菌种 ：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。

2.染色剂 ：吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)、石炭酸复红染液。

3.仪器或其他用具 ：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、玻片搁架、香柏油、二甲苯、擦镜纸、生理盐水或蒸馏水等。 四、实验步骤

1、涂片 ：取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸馏水)于载玻片中央，用接种环以无菌操作（图3-1），分别从枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液(或液体培养物)涂片，可用接种环挑取1～2环直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。

2、干燥：室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。

3、固定：如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。 图 3-1 涂片、干燥和热固定。

4、染色：将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液1～2滴于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色1～2min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min 。

5、水洗：倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。

6、干燥：甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。 7、镜检：涂片干后镜检。涂片必须彻底干燥后才能用油镜观察，否则可能导致菌体脱落。

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图3-1 无菌操作示意图

图解：（1）将菌种斜面放在左手中指和食指之间，大拇指揿住试管。并使斜面向上，以便观察。 （2） 右手转动棉塞，便于拔出。

（3） 右手拿接种针，使其直立于火焰中，将接种针的电热丝部分烧红。

（4） 用小指与手掌夹取棉塞。在拔棉塞时用力不宜过猛，以免将外界杂菌带入管内。还应该注意不要将棉塞和已烧过的接种针碰到物体上。试管也应保持水平位置，并在火焰附近。 （5） 取出棉塞后，将管口均匀通过火焰。

（6） 将接种针伸入菌种管内，先与斜面顶端的培养基接触，使其冷却，然后在斜面上挑取菌体。 （7）将管口均匀通过火焰，立即塞上棉塞。

（8）用过的接种针必须在火焰中灼烧后，才能放置它处，一是防止菌种污染环境，另外，还可以防止菌种间的交叉污染。 五、实验报告

绘制单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图，标明视野，并注明其放大倍数和菌种类别。

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实验四 细菌的革兰氏染色

一、实验目的

1．了解细菌的革兰氏染色法的原理。 2．掌握革兰氏染色法的主要步骤 二、实验原理

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，

用G表示。细菌对于革兰氏染色的不同 图4-1 革兰氏阳性菌和阴性菌的细胞壁图

反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G两大类群，常用的复染液

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是番红。 三、 实验材料

1．菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。 2．染液：草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、番红液。

3．其他：显微镜、载玻片、接种环、吸水纸、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯等。 四、实验步骤（见图4-2）

1、涂片：将培养14-16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2、染色

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（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约1分钟，水洗。 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1分钟，水洗。

（3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20-30秒钟，立即用水冲净酒精。

（4）复染：用番红液染色1-2分钟，水洗。

（5）镜检：干燥后，置显微镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

图4-2 革兰氏染色的步骤

（6）检测：试利用上述方法，检测金黄色葡萄球菌的革兰氏染色反应的颜色。

注意事项：①酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为好。②被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的培养时间过长,或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反应,所以被检菌的菌龄一般最好在18-24h之内。 五、实验报告

1.绘出枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的形态图,注明放大倍数及颜色。 2.哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？

3.进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 4.不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？ 5.如果涂片未经热固定，将会出现什么问题?

6.你的实验结果与课本中所述是否一致?如不一致,试分析原因。

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