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核心要点一
1．限制性核酸内切酶
| 基因工程中的工具酶
(1)作用特点：具有专一性，表现在以下两个方面 ①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。 ②能够切割特定序列中的特定位点。
(2)识别序列的特点：遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
GC?GCCCAGG如?以中心线为轴，两侧碱基互补对称；CG?CGGGTCC对称。
(3)作用产物：黏性末端或平末端。
①黏性末端：是限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的，如图所示：
以为轴，两侧碱基互补
T
A
②平末端：是限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：
2．限制性核酸内切酶与DNA连接酶的关系 (1)区别： 限制性核酸内切酶 作用 使特定部位的磷酸二酯键断裂 应用 用于提取目的基因和切割载体 ..
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DNA 连接酶 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键 用于目的基因和载体的连接 (2)两者的关系可表示为：
3．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较 比较项目 相同点 是否需要模板 接DNA链 不同点 作用结果 用途 作用过程 DNA连接酶 DNA聚合酶 作用实质相同，都是催化磷酸二酯键的形成 不需要 双链 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将已存在的DNA片段连接 基因工程 . [题组冲关]
需要 单链 将单个核苷酸加到已存在的DNA单链片段上，形成磷酸二酯键 合成新的DNA分子 DNA复制 1．下列关于几种酶作用的叙述，错误的是(..)
A．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接 B．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录 C．一种限制酶能识别多种核苷酸序列，并切割出多种目的基因 D．DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链
解析：选C.限制酶具有专一性，一种限制酶一般只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子。DNA连接酶能使不同DNA片段的脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接，重新形成DNA分子；RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录；DNA聚合酶能以DNA的一条链为模板，把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链，复制形成新的DNA分子。
2．(江苏高考改编)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列
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问题：
限制酶 识别序 列及切 割位点 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ HindⅢ
图1
图2
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用__________________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。
(2)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________________________，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(3)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。 解析：(1)基因工程中选择合适的限制酶切割质粒和目的基因时，应保留目的基因和至少一个标记基因结构的完整性，即遵循“目的基因切两侧，标记基因留一个”的基本原则，最好选择切割产生不同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入带来的不正常表达，因此据图分析应选择的限制酶为BclⅠ和HindⅢ，切割后质粒上保留的四环素抗性基因作为标记基因。酶切后的载体和目的基因通过DNA连接酶的作用形成重组质粒。(2)因为BclⅠ和
BamHⅠ酶切产生的黏性末端相同，所以可以被DNA连接酶连接，连接部位的6个T GATC C?G GATC A?碱基对序列为??，但是连接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和
A CTAG G?C CTAG T?
BamHⅠ的识别序列，连接部位不能被这两种酶切开。(3)由图可知，能被限制酶
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BclⅠ和BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ识别并切割，因此图中质粒上存在3个Sau3AⅠ的切割位点，若将3个切割位点之间的DNA片段分别编号为a、b和c，则完全酶切(3个切割位点均被切割)会产生3种大小的DNA片段，即为a、b和c；考虑只切1个切割位点，有三种情况，都产生一种大小的DNA片段，即大小均为a＋b＋c；考虑切2个切割位点，则会产生a＋b、c、a＋c、b、b＋c、a几种不同大小的DNA片段。综上所述，若用Sau3AⅠ识别并切割图中质粒，最多可获得7种大小的DNA片段，即为a＋b＋c、a＋b、a＋c、b＋c、a、b、c。
答案：(1)BclⅠ和HindⅢ.DNA连接 T GATC C?G GATC A?(2)??.都不能.(3)7 A CTAG G?C CTAG T?
[方法规律]
限制酶的选择技巧 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶， 如图甲可选择PstⅠ； 根据目的基因两端的限制酶 切割位点确定限制酶的种类 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶， 如图甲不能选择SmaⅠ； ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接， 也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒， 如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶 (但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点) 根据质粒的特点 确定限制酶的种类 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致， ..
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