过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1 - 图文

加入不同病毒量的细胞样品，通过提取总RNA后反转录为cDNA，然后进行定量PCR检测，通过比较control组和试验组的Ct值差异判断滴度值。通常情况下，认为Ct值差异2以上存在显著差异。

反转录反应所获得的20μl cDNA中只取了1μl用于实时定量检测，所以该结果仅表示1/20样品的情况，所以在滴度计算时应该乘以系数20。

在本次滴度检测中，1.00E-03μl组样品和control组样品的Ct值差异大于3以上，所以认为在1.00E-03 μl组样品中存在病毒颗粒。假定该组样品含有至少有1个病毒颗粒，则病毒的滴度为：

1/(1.00E-03) ×20＝2.00E+4 TU/μl=2.00E+7 TU/ml 滴度值：>2.00E+7 TU/ml

熔解曲线

Actin的熔解曲线

GFP的熔解曲线

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熔解曲线说明：

由于SYBR GreenⅠ与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析SYBR Green Real-Time PCR定量结果。

在PCR结束后，我们可以根据变性过程中的荧光值变化绘出每个样品的熔解曲线。绘制熔解曲线时，Real-Time PCR 仪连续监测每个样品在从双链完全配对到完全解链的升温过和中荧光值的变化过程。不同的扩增产物因为其长度和GC含量不同而在不一样的温度下解链，当产物解链时，SYBR GreenⅠ的荧光值将降低并被仪器监测到。由此绘制出荧光强度随温度变化的负一次倒数图。荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）即为熔解峰值。熔解曲线是扩增反应的质控途径，图中没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。

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参考文献

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