GPNMB促进周围神经损伤修复的作用及其机制

GPNMB促进周围神经损伤修复的作用及其机制

周围神经损伤是临床常见损伤,损伤后的再生修复涉及很多因素,其中施万细胞(Schwann cells,SCs)在周围神经损伤修复中发挥着重要的作用。周围神经损伤后,SCs通过上调多种神经营养因子(neurotrophic factors,NTFs)和粘附分子的表达,并在损伤局部募集巨噬细胞,与巨噬细胞共同吞噬裂解的轴突和髓鞘,改善再生微环境;在基膜内形成Büngner’s带,引导轴突再生;轴突再生后,SCs包绕其形成髓鞘,促进神经功能恢复。

损伤远侧端SCs长期失神经,则导致周围神经再生能力下降,影响神经修复。因此,激活失神经SCs,促进SCs增殖、分化、迁移、表达和分泌NTFs等,或者通过补充外源性营养因子、小分子物质等改善再生微环境,是治疗周围神经损伤的重要策略。

非转移性糖蛋白黑色素瘤蛋白B(Glycoprotein Non-Metastatic Melanoma Protein B,GPNMB),也叫骨活化素(osteoactivin,OA)、树突状细胞肝素整合素配体(dendritic cell-heparin integrin ligand,DC-HIL)、造血生长因子诱导的神经激肽-Ⅰ型(hematopoietic growth factor inducible neurokinin-Ⅰtype,HGFIN),是一种Ⅰ型跨膜蛋白,最早发现于黑色素瘤细胞中。GPNMB广泛分布于中枢神经系统,具有非常重要的作用:如改善记忆、抗炎、减少神经元死亡、保护神经元。

GPNMB在周围神经系统特别是SCs也有表达,然而,它对SCs和周围神经系统是否有激活或者保护作用,以及在周围神经再生修复中的作用仍不清楚。基于以上考虑,本研究通过对坐骨神经损伤后远侧端进行基因芯片分析,了解GPNMB在周围神经损伤后的表达变化,并探讨GPNMB对周围神经损伤再生修复的作用和对

SCs的作用及其机制,为GPNMB的临床应用提供理论和实验基础。

第一部分坐骨神经损伤后GPNMB的表达变化目的:通过对坐骨神经损伤后远侧端进行基因芯片分析,以了解损伤神经远侧端基因表达变化,尤其是GPNMB的表达变化。方法:对坐骨神经横断伤后0、1、3、7、14、21、28 d,远侧端进行基因芯片分析,STEM分析筛选表达变化趋势显著性的基因集,并对其进行生物信息学分析和聚类分析。

筛选出其中变化最明显的基因,并使用qRT-PCR、免疫印迹(Western bloting,WB)、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)对其在转录和蛋白水平进行验证。结果:在坐骨神经横断损伤后0、1、3、7、14、21、28 d,远侧端基因表达趋势显著性的基因集共有12个,其中基因集41的表达趋势在坐骨神经损伤后先上升、至峰值、继而下降,而这种变化趋势与远侧端急性失神经SCs的增殖趋势相一致。

GO、KEGG分析预测基因集41中的基因可能参与细胞增殖过程。聚类分析发现GPNMB是基因集41中表达变化最明显的基因,其表达从1 d开始上升、从3 d开始迅速上升,至7 d时上升至峰值,约为0 d的48倍、从14 d开始下降,直至28 d下降至0 d的15倍左右。

qRT-PCR、WB、IHC结果显示GPNMB的表达趋势和芯片结果基本一致。结论:在坐骨神经损伤后,损伤远侧端GPNMB表达变化最明显,且呈先上升、至峰值、继而下降的趋势,GPNMB可能参与坐骨神经损伤后的自我再生修复过程,尤其是细胞增殖的过程。

第二部分GPNMB促进坐骨神经损伤再生修复目的:探讨GPNMB对坐骨神经损伤再生修复的作用方法:坐骨神经重度压榨伤模型建模后3周,于损伤处由远及

近、多点注射重组人GPNMB(rhGPNMB)蛋白或PBS,实验大鼠共分为3组:PBS组、100ng rhGPNMB组、500ng rhGPNMB组,并于4周后进行检测。免疫荧光检测SCs增殖及轴突、髓鞘的再生;透射电镜观察髓鞘的超微结构并计算G-Ratio值;体外检测损伤神经兴奋传导速度和动作电位振幅;注射rhGPNMB后的每周观察大鼠行走足印、计算坐骨神经功能指数,检测神经功能恢复情况;观察腓肠肌大体形态、对腓肠肌称重、HE染色检测其萎缩情况。

结果:rhGPNMB组SCs数目、再生轴突数、再生髓鞘数以及增殖细胞核抗原的表达均明显多于PBS组,差异具有统计学意义。100ng rhGPNMB组和500ng rhGPNMB组的SCs数量分别为PBS组的1.55±0.21和2.75±0.28倍,且形状和排列上更加规则;再生轴突数为PBS组的1.38±0.19和1.78±0.18倍,且分布更加均匀、直径更大、延续性更完整;再生髓鞘数分别为PBS组的1.18±0.18、1.67±0.08倍,且完整性更好、分布更加均匀。

透射电镜结果显示:rhGPNMB组再生髓鞘数多于PBS组,形状更加完整、髓鞘板层较厚且更加致密,微管、微丝等超微结构排列更规则。计算G-Ratio值,500ng rhGPNMB组G-Ratio值最小,表明其再生髓鞘厚度最厚,差异具有统计学意义。

体外检测发现,100ng rhGPNMB和500ng rhGPNMB两组的动作电位振幅分别为PBS组的1.10±0.22和1.44±0.30倍;神经兴奋传导速度分别为PBS组的1.32±0.08、2.15±0.17倍,差异具有统计学意义。按照3组大鼠行走足印,计算坐骨神经功能指数,PBS、100ng rhGPNMB、500ng rhGPNMB 3组坐骨神经功能指数均有降低,至第4周3组的坐骨神经功能指数值分别为-72.83±5.85、-60.06±4.77、-40.60±5.00,差异具有统计学意义,表明坐骨神经在损伤再生修复过程中,3组神经功能均有一定的恢复,而rhGPNMB可促进坐骨神经损伤后功能的进一