土壤微生物数量测定方法整理

土壤微生物的分离鉴定及数量测定方法

⑴细菌:10-4~10-6 ⑵放线菌：10-3~10-5 ⑶真菌：10-2~10-4

以上采用稀释平板法，分别设置三个浓度梯度，二次重复。 ⑷亚硝酸细菌：10-3~10-6 ⑸硝酸细菌：10-3~10-6 ⑹反硝化细菌：10-4~10-7 ⑺好气性自生固氮菌：10-3~10-6 ⑻氨氧化细菌：10-5~10-8 ⑼好气性纤维素分解菌：10-2~10-5

以上采用最大或然法（MPN），分别设置四个浓度梯度，三次重复。 4.接种(平板接种技术)

平板接种是用接种环将菌种接至平板培养基上,或用移液管,滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上,然后进行培养.其目的是进行菌落形态观察,分离纯化菌种,活菌计数,或进行其它试验.其方法有多种,根据实验的目的要求不同,可分以下几种. ①斜面菌种接至平板

划线法:按无菌操作的方法自斜面用接种环直接取少量菌体,在平板培养基表面自左至右轻轻连续划线或分区划线,注意不要划破培养基.或先制成菌悬液,接种在平板边缘的一处,将接种环灼烧灭菌,再从有菌的部位如上方法划线接种.

点接法:一般用于霉菌菌落观察的接种.无菌操作下,用接种针从斜面或孢子悬液中取少量孢子,轻轻点接在平板培养基上,点接的部位和点接的次数根据实验目的与要求确定. ②菌悬液接至平板

涂抹法:用灭菌的移液管或滴管吸取一定体积的菌液移至平板上,然后用无菌的玻璃涂棒将菌液均 匀涂布在整个平板上.

混菌法:先将菌液加入培养皿中,然后加入融化并冷却至45～50℃的固体培养基,轻轻摇匀,平置,待完全凝固后倒置培养. ③平板菌种接至斜面

此法一般是将分离培养得到的单菌落,在无菌操作下分别接种到斜面培养基上,以便进一步扩大培养或作保存之用.接种之前先选好平板上的单菌落,并做好标记.左手拿平板,右手拿接种环,在火焰上方或火焰旁边操作,灼烧接种环后将接种环在空白培养基处冷却,以免将菌种烫死,然后挑取菌落,在火焰旁边稍等片刻,此时左手将平板放下,拿起斜面培养基,按斜面接种的方法接种. 5.培养

将所有试管和平板置于25-28℃黑暗条件下避光培养。培养时间由短到长分别为： ⑴真菌：2～3d； ⑵细菌：3～4d；

植保学院烟草实验室 张丽

⑶放线菌：5～7d。 ⑷氨氧化细菌：7～8d； ⑸好气性自生固氮菌：7～8d； ⑹亚硝酸细菌：10～14d； ⑺硝酸细菌：10～14d； ⑻反硝化细菌：10～14d； ⑼好气性纤维素分解菌：10～14d； 6.结果观察

⑴亚硝酸细菌：取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液各两滴，如有亚硝酸盐存在，则呈红色。

⑵硝酸细菌：取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液各两滴，如不呈红色，表示亚硝酸均已经完全消失。此时，另取培养液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺试剂2滴，如呈蓝色，则表示亚硝酸已经被氧化成硝酸，说明有硝酸细菌的存在。 ⑶反硝化细菌：加入格利斯亚硝酸试剂，观察颜色变化，确定正负反应。

⑷好气性自生固氮菌：观察试管培养液表面与滤纸接触处有无褐色或黏液状菌膜生成，或有无圆晕混浊出现。

⑸氨氧化细菌：取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入纳氏试剂两滴，如有氨氧化细菌存在，则呈棕色或褐色。

⑹好气性纤维素分解菌：观察滤纸条是否成团，有无黄色或橘黄色菌斑出现及滤纸断裂情况。 7. 镜检计数

稀释平板菌落计数

平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法. ⑴混合平板培养法

将无菌平板编上10-7,10-8,10-9号码,每一号码设置三个重复,用无菌吸管按无菌操作要求吸取1×10-9稀释液各1mL放入编号10-9的3个平板中,同法吸取10-8稀释液各1mL放入编号1×10-8的3个平板中,再吸取1×10-7稀释液各1mL放入编号1×10-7的3个平板中,由低浓度向高浓度时,吸管可不必更换.然后在9个平板中分别倒入已熔化并冷却至45～50℃的细菌培养基(图5-2),轻轻转动平板,使菌液与培养基混合均匀,冷凝后倒置,在30℃下培养.至菌落长出后即可计数. ⑵涂抹平板计数法

涂抹平板计数法与混合法基本相同,所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上,每个编号设三个重复.再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀(图24-3),每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌.在由低浓度向高浓度涂抹时,也可以不

更换刮铲.将涂抹好的平板平放于桌上20～30min,使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,保温培养,至菌落长出后即可计数.

计算结果时,常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度,求出每克菌剂中的含菌数. (1)同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊.

土壤微生物的分离鉴定及数量测定方法

(2)细菌,放线菌,酵母菌以每皿30～300个菌落为宜,霉菌以每皿10～100个菌落为宜.

选择好计数的稀释度后,即可统计在平板上长出的菌落数,统计结果按下式计算. 混合平板计数法:

每g样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数 涂抹平板计数法:

每g样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数

尽管使用不同的培养基，但细菌、放线菌和真菌都可能在同一个培养基上生长，所以必须用显微镜做进一步的观察。明显有菌丝的一般是真菌，真菌的菌丝为丝状分枝，比较粗大；而放线菌菌丝呈放射状，比较细。细菌有球状和杆状，有些细菌也形成细小的菌丝。酵母菌的菌落与细菌的菌落很相似，但在显微镜下容易分辨。酵母菌个体比较大，一般有圆形、椭圆形、卵形、柠檬形或黄瓜形，有些还有瘤状的芽。

在两级稀释度中，选细菌和放线菌的菌落数为30～200个、真菌菌落数为20～40个的培养皿各5个，取其平均值计算出每组的菌落数。如果菌落很多，可将其分成2～4等份进行计数。微生物生物量可以通过微生物细胞个体大小和密度计算得到。 8.计算

土壤微生物数量（cfu·g-1）=MD/W

式中M为菌落平均数：D为稀释倍数；W为土壤烘干质量（g）。

植保学院烟草实验室 张丽

背景知识：

微生物

微生物(microorganism简称microbe是包括细菌、病毒、 真菌 以及一些小型的 原生动物 、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。 微生物的定义

现代定义：微生物是一切肉眼看不见货看不清的微小生物的总称。

形体微小，结构简单，通常要用 光学显微镜 和电子显微镜才能看清楚的生物，统称为微生物。 （但有些微生物是可以看见的，像属于真菌的蘑菇、 灵芝 等。）

1 特点： 个体微小,一般<0.1mm。构造简单,有单细胞的,简单多细胞的,非细胞的。进化地位低。

2 分类： 原核类: 三菌,三体。三菌：细菌、蓝细菌、放线菌 三体：支原体、衣原体、立克次氏体。真核类: 真菌,原生动物,显微藻类。非细胞类: 病毒, 亚病毒 ( 类病毒,拟病毒,朊病毒)。

3 五大共性：体积小,面积大； 吸收多,转化快 ；生长旺,繁殖快；适应强,易变异； 分布广,种类多

微生物的类群

种类

原核：细菌、放线菌、螺旋体、支原体、立克次氏体、衣原体。 真核：真菌、藻类、原生动物。

非细胞类：病毒和亚病毒。

一般地，在中国大陆地区的教科书中，均将微生物划分为以下8大类：

细菌、病毒、真菌、 放线菌 、 立克次体 、 支原体 、 衣原体 、 螺旋体 。

1 细菌:(1)定义:一类细胞细短,结构简单,胞壁坚韧,多以二分裂方式繁殖和水生性强的原核生物

(2)分布:温暖,潮湿和富含 有机质 的地方

(3)结构:主要是单细胞的原核生物,有球形,杆形,螺旋形

基本结构：细胞膜 细胞壁 细胞质 核质。特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛、芽胞 (4)繁殖: 主要以二分裂方式进行繁殖的

(5)菌落: 单个细菌用肉眼是看不见的,当单个或少数细菌在 固体培养基 啊行大量繁殖时,便会形成一个肉眼可见的,具有一定形态结构的子细胞 群落 .

菌落是菌种鉴定的重要依据.不同种类的 细菌菌落 的大小,形状光泽度颜色硬度透明度都不同.

2 放线菌

(1)定义:一类主要成菌丝状生长和以 孢子 繁殖的陆生性较强的原核生物 (2)分布:含水量较低,有机物较丰富的,呈微碱性的 土壤 中

(3)形态构造:主要由菌丝组成,包括基内菌丝和气生菌丝(部分气生菌丝可以成熟分化为孢子丝,产生孢子)

(4)繁殖:通过形成无性孢子的形式进行无性繁殖

(5)菌落:在固体培养基上:干燥,不透明,表面呈致密的丝绒状,彩色干粉