显微与电镜技术

固定”，以达到取长补短的效果。

从超微结构上看，染色体的形态与所用的固定方法有关，它总是由纤维和小颗粒两种成分所构成。经？二醛固定的或者前固定后再经锇固定的标本上，所见的往往纤维万分较多，而单用锇固定则小颗粒万分较显著。此外在？二醛固定的标本中常染色质和异染色质二者显示出明显的差别，而单用锇固定时则二者的界限不甚分明。

这里着重介绍常用的电镜固定剂及配方： 1、本氧化锇

商品四氧化锇为淡黄色结晶体，因为其挥发性和毒性，一般都密封在玻璃瓶时，通常是以0。5-1克包装。该试剂较贵重，使用时务必注意节约，此外，它在室温下很容易挥发，其蒸汽对眼、鼻喉等粘膜有强烈刺激作用，因此操作时最好能在防护通风罩内进行。

（1）四氧化锇的主要优点：

①它和蛋白质化学结合并形成交链而使蛋白质得到稳定，但并不是使蛋白质发生沉淀，因此能较好地保存生物微细结构。

②它能保护脂肪，与脂肪的不饱和脂肪酸链结合，形成脂肪一锇复合物。

③虽然它对碳水化合物保护较差，但对作为细胞支架的磷酸脂蛋白的保护很好，对核酸保护很差，而对核蛋白保护好。因为在有机体内核酸和碳水化全物都与蛋白呈复全的形式，因此四氧化锇几乎能和所有的细胞成分化学结合。

④其分子密度高，产生良好的反差，因此锇固定本身直到生物染色作用。 ⑤对缓冲液的要求 不甚严格。 （2）四氧化锇的主要据缺点：

①不能保护糖原，不能固定核酸，对微管固定较差。

②分子较大扩散较慢因而穿透力较差，大于1立方毫米的组织块不能得到守好固定。 ③挥发性和对粘膜的霉性作用。 ④不适于进行细胞化学工作。

配制四氧化锇的瓶子最好为避光的30-50毫升的棕色磨口瓶，配制前应泡酸洗净。泡酸时应当把四氧化锇安瓶（1克）预先放到瓶内一起泡洗。泡酸后应当用自来水充分冲洗并用蒸馏水涮洗数次。配时先加入少量蒸馏水于瓶中，然后盖上瓶盖用力摇，安瓶破碎使四氧化锇容化，这时再向瓶中加入足量的蒸馏水。因为四氧化锇为坚固的固体溶解很慢，因此在配固定液之前至少要有一天的时间令其缓缓溶解，特别紧急时可采用超声波助溶。

（1）磷酸缓冲的四氧化锇固定液的配制方法：

①配制合适的磷酸缓冲液，其PH一般在7。0—7。4，克分子浓度为0。1M ②如果需要可用氯化钠（作前固定时）或用蔗糖（后固定时）调整其渗透压。 ③如果需要，加入氯化钙或氯化镁（最终深度为1-3mM）注意避免发生沉淀。

④将含有固体四氧化锇的安瓿打碎，加入适量的磷酸缓冲液配成1%的四氧化锇固定液。 （2）二甲胂酸盐缓冲的四氧化锇固定液配制法：

①配制克分子浓度为0。1M，PH为7。2-7。4的二甲胂酸钠缓冲液； ②如果需要，可用蔗糖调整渗透压；

③如果需要，可加入足量的无水氯化钙或包化镁，使钙、镁的最终浓度达到1-3mM； ④将1克装的四氧化锇安瓿打碎，加入二甲胂酸盐缓冲液，配成1%的二甲胂酸盐缓冲的四氧化锇固定液。

（3）Palade氏醋酸佛罗那缓冲液的四氧化锇固定液的配制法： ①醋酸佛罗那原液。

②用以下溶液配制醋酸佛罗那缓冲的四氧化锇固定液： 2%四氧化锇水溶液 12。5毫升 醋酸佛罗那原液 5。0毫升

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0．1NHCL 5。0毫升（大约） 蒸馏水加至 25。0毫升

（4）Zetterqvist氏醋酸佛罗那缓冲的四氧化锇固定液配制法： ①醋酸佛罗那钠缓冲液。 ②灵格氏液。

③用以下溶液配制缓冲固定液：

2%四氧化锇水溶液 25。0毫升 醋酸佛罗那原液 10。0毫升 灵格氏液 3。4毫升

0．1NHCL 11。0毫升（大约）

此外Coulfield改良了Palade固定液，因为后者为低张性溶液，因此在每100毫升的Palade氏溶液里加入4。5克蔗糖，调整其渗透压之后就是Coulfield固定液。 2、？二醛

六十年代初由Sabatini等首先用？二醛作为细胞化学的固定，但是醛固定剂处理的标本反差很差，需要四氧化锇的二次固定，这就是至今被广泛采用的双固定。 （1）？二醛固定剂的主要优点在于：

①对组织的穿透能力较强，较快，因而突破了锇固定对组织块的严格限制，组织块可适当增大到数毫米也并不影响固定效果。

②在进行锇“后固定”之明，固定的组织可在冷的环境下长期保存在缓冲液内（数周到数月均可）不致产生不很后果，这一特点尤其对于野外工作或远离实验的现场取材提供了委大方便，现场取材的标本在缺乏？醛的情况下，用中性福尔马林也可以得到良好的效果。

③它能补偿锇固定的不足，对糖原、核蛋白、尤其是对微管、内质网等细胞膜系统和细胞基质有较好的固定作用，？二醛的二个醛基，在固定时以交链作用使细胞成分得以稳定，因而避免了用锇用原始固定剂可能产生的胞浆内外基质的丢失。 ④适于进行超微细胞化学研究。 （2）？二醛固定的主要缺点在于：

①它对脂质不起固定作用，经？二醛单元独固定的组织经脱水之后大部分脂质被抽提而丢失。因此它也不适于单独作为固定剂，最好作为锇固定的前固定剂使用。 ②反差较差。

③？二醛固定不影响细胞的渗透性，因此对缓冲液的渗透要求较高。 ④对缓冲要求条件较严格，固定效果与缓冲液有很大关系。

市售的？二醛通常是25%或50%的水溶液。大多数市售？二醛水溶液含有杂质，其光谱吸收在235毫微米，而纯的单体？二醛的吸收光谱为280毫微米，平常这种原液应保存在4℃或-20℃，不应当加碳酸钡。如果其PH降到3。5以下时则不能使用。

在进行细胞化学或免疫学等特殊实验时，？二醛应当经过活性炭纯化或蒸馏提纯。活性提纯法是将市售25%的？二醛按加入10%（W/V）的活性炭在4℃下摇荡一小时然后过滤。这种吸附提纯方法可重复2—3次，直到紫外光谱吸收达到标准为止。

根据Gillet等的经验，提纯的？二醛保存时的温度十分重要，在-20℃下保存八个月并不产生杂质，4℃下8个月这后只能见到235毫微米的小峰，然而室温下很短时间就可产生较大的光谱吸收高峰。实验证明惰性环境（氮气）或无沅环境对它的保存并无重要影响。

市售？二醛的准确浓度不详，如果需要测定其准确浓度，光密度应为280毫微米。 ？二醛固定液的配方

经验证明，？二醛固定液对缓冲液的要求较高，因此在配制时应当认真从事。一般选用磷酸缓冲液配制固定液效果较好，下面介绍几种配方。

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