经70%的乙醇脱水、封藏。
②明矾洋红：
洋红1克，硫酸铝铵10克，？？水100毫升
先将硫酸铝铵溶于？？水，次将洋红加入，煮沸，用玻棒充分搅和使洋红溶解，冷却过滤后，加入少许防腐剂（如：？香草酚，水杨酸钠，樟脑粉，石炭酸等）以防生霉。
此为核染色剂，在动物方面应用较广如原生动物、寄生虫、胚胎学等材料均得良好效果，也可染高等植物的表皮及蕨类的原叶体。
此液染色简易方便，无浓染之弊，但因染色力较低，不适于大形组织。 ③醋酸洋红：
洋红4—5克，冰醋酸45毫升，？？水55毫升
将洋红粉加入水及醋酸中在小火焰上加温，煮沸用玻棒搅和使其溶解冷却后该液呈暗红色，过滤，为饱为干液，密封保存。 用时以99份？？水稀释。
此染液渗透作用极快，着色美观兼有杀死作用，对新鲜组织有核染色较好，最适于动、植物新鲜的细胞学材料的急速观察，如无脊椎动物的精巢和卵细胞，以及上皮组织等材料的中心体和染色体，植物的根尖、花药都能显示出来。
经此液染过的材料用水洗涤，洗去冰醋酸即可脱水封藏。 ④ 锂洋红：洋红2。5克，碳酸锂1。5克，？？水100毫升 将洋红加入碳酸锂水溶液内，煮沸冷却过滤，即可使用。
此液主要适用于组织切片的染色，为核的染色剂，胞核呈深红色，胞质亦能着色呈淡红色。染色后用盐酸水分色即可脱水封片。
2酸性染料（细胞质染料）
它可对细胞的碱性颗粒着色，因此这些颗粒叫做嗜伊红颗粒或嗜酸性颗粒。这种染料还被用来与亚甲蓝配合成“中性染料”以作血液染色，例如：Wright和Giemsa氏染液。
（1） 酸性品（复）红：为红色粉未，是碱性品红的一个磺化衍生物，所以是酸性染料。它是良好的胞浆染色剂，应用极广，在动物组织学方面它可用于Van Gieson氏及Mallouy氏结缔组织的染色剂，也可用它和苦味酸染色鉴别平滑肌和结缔组织。在植物制片技术中用以染皮层，髓部及纤维质壁，如与甲基绿同染色可显示线粒体。 酸性品红很易与碱作用，所以过染后，易在自来水中脱色，切片先浸入带酸性水中后再染色，可使染色力增强。
（2） 水溶性苯胶蓝：又称棉蓝是一种酸性染料，深蓝色粉未。用于动物组织学中的对比染色，能显示胞质、神经轴，用它和苏木素可作成多色性染剂，供组织的常规检查，也可与碱性品红、桔黄G等作对比染色，Mallouy法染结缔组织中常用。在植物学方面常用作显示鞭毛及非木质化组织，也是菌藻植物的常用染色剂。
（3） 刚果红：属偶氨染料，又称棉红B，是一种酸性染料，枣红色粉未，因为它的钠盐是红色，遇酸变蓝色，能溶于水及酒精，它既能做指示剂，又能做染料，常配成1—2%的水溶液。
刚果红可与苏木素作二重染色，也可作类淀粉染色，因其易为水及酒精洗去，故在洗涤及脱水时要快速处理，在动物组织学中可用神经轴、弹性纤维、胚胎材料的染色剂。在植物切片上常用以染粘液及锈菌，并可显示胞质及纤维质。
（4） 橘黄：属于偶氨染料类。为酸性染料，能溶于水、乙醇、丁香油，为一种胞浆染料，常用二重及多重染色用。如用作铁明矾苏木素的对比染色，Mallouy法染结缔组织，与龙胆紫合并用于染胰岛的a和в细胞。
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常用配方：
①水溶液：橘黄G1克，蒸馏水100毫升
②酒精溶液：橘黄G1克，95%的乙醇100毫升
③丁香油溶液：橘黄G1克，纯酒精50毫升，丁香油100毫升（配制丁香油溶液时，先将橘黄溶于酒精，再加入丁香油，然后开启瓶口，放在30℃的温箱中，使酒精蒸馏发为止。）
橘黄无过染的缺点能洗去其它染料。纯酒精饱和溶液和水溶液均能保存。
⑤甲基蓝：为苯甲烷染料，是强酸染料，能溶于水及酒精，是一种极重要的胞浆染料，也是一种很好的对比调色剂，与伊红合用能染神经细胞，在动植物的制片技术方面应用广泛，也是病理学及细菌学不可缺少的染料，它的水溶液又为原生动物的活体染色剂。
配方有二：
①水溶液：甲基蓝1克，氯化钠0。6克，蒸馏水100毫升 ②酒精溶液：甲基蓝1克，70%酒精100毫升
材料经染色后，必须洗涤，在脱水时也是洗去，此种染料也极易氧化，染色后不能
长久保存。
⑥伊红：为染细胞浆、肌纤维、嗜酸性颗粒等常用的染料，它是一种钠或溴盐的酸
性染料，常与苏木素合染，对比染色简称H。E染色。它的种类很多，名称也不统一，一般多用伊红Y。
伊红Y：它是四溴莹光素，分子量691。906。但其中常含一溴及二溴衍生物，它会影响到它的色调，含溴 愈多，颜色愈红。市售品即为这类化合物的混合物。它易溶于水（15℃时达44%），较不溶于酒精（2%的无水酒精），不溶于二甲苯，为红中带蓝的小结晶或棕色粉未，浓水溶液为暗紫色，稀溶液为红黄色至红色，有黄绿色萤光反应。浓酒精溶液为红黄色，稀液为红色，萤光与水溶液间。它是一种很好的胞浆染料，组织病理学上常与苏木素进行对比染色，应用极广。如遇染色困难可在100毫升伊红溶液内加1—2滴冰醋酸。
此种伊红因易于溶解于水习惯称为“水溶性伊红”其实除乙基伊红不溶于水外，其他种类均溶于水及酒精只是溶解量不同而已。通常用于碱性染料染色之后为0。1%伊红水溶液，因溶液稀，酸性小，可不影响先染的盐基性染料。 （7）三硝基苯酚
它是硝酸作用于苯酚而制成的，为黄色的结晶体，干燥放置能引起爆炸，因此常配成水溶液或酒精溶液保存，是细胞质的一种黄色染色剂，常与酸性品红、结晶紫作对比染色。
除此之外，酸性染料还有地衣红、醇溶性苯胶蓝、甲基蓝、偶氨胭脂红B、藻红B、茜紫红等。 3、中性染料 （1）？氏染色粉：为一种深蓝色的粉状物。用它配制瑞氏染色液对细胞的酸性、碱性和中性成分都显示出来，通常用于血液涂片染色。
（2）姬姆萨染色粉：是一种蓝黑色粉状物，常用于血液染色。 4、脂肪染料
大多数脂肪染色显弱酸性，特别容易溶于脂肪。这类染料与不同的脂肪化合即呈现染色作用，全过程应避免与其它有机溶剂相接触。常用的脂肪染料有油溶红—O、苏？红、苏？黑、油溶蓝—NA等。 5、金属染料
金属染料的着色通过浸润法（镀染法），实质是金属离子与组织结构产生沉淀作用。
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常用的金属染色有银（硝酸银）、金（氧化金）及锇（四氧化锇）。 6、活体染料
常用的活体染料有中性红、台盼蓝、亚甲蓝等。 三、染色方法
生物切片技术方面所应用的染色方法很多，现将苏木精—伊红染色步骤介绍于下：由于要染的切片尚包在石蜡中，而所用的染剂又常常为水溶液，因此在染色之前，必须再度复水。石蜡切片在二甲苯中溶去石蜡，经各级酒精下降到水（称为下行复水；染色后再经各级酒精脱水（称为上行脱水）上升到二甲苯，然后封片。
苏木精—伊红染色法是生物制片技术中最常用的方法。它染色广范，可染任何固定液固定的材料，且不易裉色，便于长期保存。但用此法制作优良切片也不容易，染色成败的关键在于分化，如果分化不当，该脱色的部分未脱色，或分化不足，染色浓淡不均，复染时便不能得到对比鲜美的色彩。 操作步骤：
（1）取已干燥的切片放入纯二甲苯中脱蜡15—30分钟（其间换液一次）。脱蜡必
须彻底，如果室温过低，也可在温箱（45℃左右）中脱蜡。 （2）依次移入纯酒精+二甲苯（1：1）、纯酒精Ⅰ、纯酒精Ⅱ、95%酒精、85%酒
精、70%酒精、50%酒精中2—5分钟。 （3）移入苏木精染液中15—25分钟。
（4）入自来水中（流水）直到颜色变蓝（或入碱水中也可），镜检至蓝色适度止。 （5）入酸酒精中分色几秒至几十秒钟。该步为染色成败的关键，时刻注意镜检至
颜色适度。
（6）入流动的自来水（或碱酒精）中蓝化，镜检核变蓝为止。 （7）入蒸馏水过洗一次。
（8）脱水，切片入50%、70%、85%的酒精各2—5分钟
（9）入95%的伊红酒精溶液染1—3分钟。伊红主要染胞浆，着色浓淡应与苏木
精染胞核的浓淡相配和，如胞核染的浓，胞浆也应染浓，以求对比鲜明；反之，亦然。如遇到伊红不易着色，可滴加冰醋酸数滴以助染。 （10） 入纯酒精Ⅰ、纯酒精Ⅱ脱水各2—5分钟。 （11） 入二甲苯+纯酒精（1：1），二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5—10分钟 （12） 滴加中性树胶于标本上封固。
染色结果：细胞核呈蓝色，核仁呈深蓝色；细胞质、纤维呈深？不同的红色。
四、染色应注意的问题
（1） 染色之前，应该根据材料的结构和性质或者一定的观察目的来先定染色方
法。 （2） 材料从溶液中取出放入染色液时，此两种溶液的浓度应当相同。例如，在水
溶液的染料染色，材料必须过渡到水中才进入；在50%酒精溶液的染料染色应过渡到50%酒精进入。 （3） 染色宁可较深，不可太浅，一般在染色后，必须注意分色，此工作很重要。 （4） 加酸或碱褪色后，必须注意彻底洗净，否则以后再染他种染料时不易成功，
同时制好的片子本身的颜色也会渐渐褪掉。 （5） 染色及分色的步骤，每种染色虽然有一个时间范围，但因材料性质不同或其
他条件不同，往往可以有出入，所以时间很难死板规定，工作者应该灵活掌握制作开始时最好以少数材料作尝试，成功后，再以同样的时间和方法大量制作，以免造成意外的损失。 （6） 染色后或已制成制片，不可置于日光下，以免褪色。
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第八节 封固 一、封固剂
切片经染色完成后，要用封固剂来进行固定成为制片。用来封固的物质，要求透明而折光率高，并且要求干燥后能凝固，常用的封固剂有下列数种：
（一）加拿大树胶：加拿大树胶是最常用的封固剂，溶于二甲苯或苯中即得。用于滑动切片时，须要稍浓一些，用于石蜡切片的则需要稀些，不需加热，绝对不能混入水及酒精。
（二）甘油胶： 明胶：1份 蒸馏水：6份 甘油：7份
每100毫升混合液中加石炭酸1克。
配制：取明胶于水中（可放在40—50℃温箱中）待胶全部溶解后，加入纯甘油，最后加入石炭酸，不断搅拌至完全均匀为止，经过滤盛于瓶内而冷却后为凝固冻状，用时再经水溶微热便可融化应用。用时最好取一小部分，不要时常加热，以免变坏。 甘油胶封固后，在盖玻片的四周可用瓷漆封边。
（三）糖浆：对于不能经酒业及二甲苯处理的材料，常用糖浆进行封固，其配制：酒精：3克，麦芽糖：0。25克，蒸馏水：3毫升，0。1%石碳酸：1滴 二、封因技术
①准备好盖玻片、载玻片、镊子、树胶、酒精灯； ②将有标本的载玻片自二甲苯中取出； ③用白布或滤纸揩去标本周围的二甲苯； ④在标本上加一滴树胶或其他封固剂；
⑤如果封固剂带有气泡可将载玻片置于酒精灯火焰上来回摆动2—3次，以除去气泡。
⑥将盖玻片一端先与树胶接触，然后缓缓抽去镊子，让盖玻片缓缓下降。
用甘油、甘油胶、糖浆等封藏的标本，因易受霉菌侵染，同时上述之封固剂因易受热熔化，使盖玻片脱落，因此，必须经过密封处理；
①盖玻片和载玻片必须绝对干净，如有油渍可用白布蘸70%或95%的酒精轻轻揩试； ②盖玻片的周围必须干净，如有水汽或封固剂透出应除掉； ③盖玻片内不能有气泡存在；
④用毛笔蘸取浓度适宜的瓷漆少许，在盖玻片的周围封成一薄层。
封固完毕后，要粘贴上标签，这是制片最后的一个程度，同时可装入切片盒平放于32℃左右的温箱内烘干，或置于室内让其自干后为即成品。
第三单 其它切片法
第一节 冷冻切片法
此法对于水分较多且易收缩的材料很适合，若用一般方法则很难获得良好结果。此法是利用滑动切片机或手摇切片机，装上特别设计的冷冻装置而进行切片，因为材料通过冷冻过程，使细胞在很短时间内冻结、保持生活状态，并且也很少有收缩现象。这种方法还可以保存材料内的脂肪、橡胶等物质。在医学上，冷冻切片法能及时获得病情原委，以作急速诊断。
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