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显微与电镜技术

来源:用户分享 时间:2025/5/20 21:23:55 本文由loading 分享 下载这篇文档手机版
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为0。1毫米。

由于副标尺的每小格为主标尺的9/10,首先看到副标尺的“0”点位置,如在12毫米和13毫米之间,然后仔细观看副标尺与主标尺的一致点,若副标尺的8与主标尺的20的刻度安全合在一条直线上,从而得知游标尺所表示的位置数值为12。8毫米(图2—2—1)。 在进行测量被检物体的大小或长度时,可借助目镜内安装的指针,先测出一个数值,再移动被检物测出的第二个数值,两数之差即为该读体的大小或长度,测量被检物体的纵向和长度, 就利用纵向游标尺。由于测得的数值单位为毫米,因此这种测量不如显微镜来得精确。

第二节 显微镜微尺

显微测微尺是用来测量视场中被检物体的大小、长短的工具。包括有目镜测微尺和测微台尺(也称镜台测微尺),用时必须两者互相配合,才能完成其测量效用。

目镜测微尺为一圆形玻璃片,其上有刻度,常用的分为5格,每格分10小块(共50小格)如图2—2—2所示:而测微镜台尺为一特制的载玻片,其中央胶粘一小圆形玻尺,刻有尺度,一般为1毫米,分10大格,每格分为10小格(共1000倍),每小格等于10UM,如图2—2—2所示。

使用方法:利用普通显微镜作测微时,可将目镜的接目镜旋下,把目镜测微尺正面放在视场光?上,再将接目镜旋上,但应特别指出,研究用显微镜的目镜结构精密,不允许随便拆卸,要使用本身带有测微尺的目镜,进行观察时,在显微镜的视场中将清楚地看到具有数字的刻度,将测微台尺放置地载物台上,调焦后在视场中可同时看清台尺的刻度,观察时先使用两者的刻度从“0”(或为10、20)刻度完全重叠,再向右找出这两尺上的刻度又在何处重叠,然后记下两尺重叠的格数,以便计算出目镜测微尺每小格在该放大率下的实际大小。

计算方法:目镜测微尺每小格=台尺重叠格数X10/目尺重叠格数

例如目镜测微尺上的第5格与测微尺上的第8格重叠,就可知道目镜测微尺上的5小格=8X10(因测微台尺每小格等于10μM) =80μM ,而目镜测微尺上的每小格则为80/5=16μM。

当确定目镜测微尺每小格的数值后,在测定被检物体的大小,长短时,必须在原显微镜的放大率下进行,否则目镜测微尺的数值又变化,如改变倍率应重新再测。

测量时,不再用测微台尺,在视场中只利用目镜测微尺便可测出,例如某一部位的大小为4小格时,即4X16=64μM。

第三节 描绘器

描绘器的形式有多种,但它们的基本原理则相同,即将两个不同的视场合并在一起。观察时,一方面接受显微镜所成的图象;另一方面将显微镜外方的绘图纸、笔和手投射进入场内。

老式显微镜的描绘器主要是阿贝描绘器和描绘目镜。使用时先取下目镜将它们夹在镜筒上,再放回目镜,镜外放一台灯,照射于纸上,经调焦观察到被检体后,将它转到目镜的上方,则可在视场内同时看到被检物体和纸、笔和手的形象。调节好光线后,即可沿着物象之轮良好进行描绘。

新型研究用显微镜的描绘器虽然原理和上述相同,但成为显微镜的蹭附件,不处于目镜的上方,而是在物镜与目镜之间,镜外亦需放置一台灯,照射在绘图上,它的优点是不需调整角度,因描绘器内的平面反射镜已固定为45度角,外方形象的投入是通过其中的一个目镜(为照相镜),使投入的象质优良充满视场,便于描绘,观察时亦不易疲劳。

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它的调节是利用在描绘器上有一手柄,同时还有调节环,因此操作十分方便。 所描绘的图其放大倍数的计算方法:

1)用第二节显微镜法先测出被检物体的实际大小,再用尺量出图的大小,即可算出放大倍数,如反测被检物体为200微米,而描绘出来的图为6厘米,即50毫米,因1毫米等于1000微米,则50X1000=500000微米;而被检物体实测为200微米,再以500000除以200=250,即所绘出的图放大为250倍。

2)用第一节游标尺的使用方法测出被检物体的大小,再以上述方法计算,即得出所描绘的放大倍数。

用描绘器描绘出来的图,只是一个轮廓图,而且线条很难精细美观,向前进一步加工绘制和取舍,突出图的重点部分。

第四节 投影屏和投影目镜

研究用显微镜附有投影屏,当投影屏替代显微照相装置时,显微照相的目镜就成象在投影屏幕上,即成为“投射显微镜”。投影屏的优点在于可多人同时进行观察和研究,但必须在较暗的室内才能取得良好的效果。投影屏的屏幕系由毛玻璃做成,由于毛玻璃本身具有“麻点”,对图象清晰度将有不良的影响,为了消除这一缺陷,增强投景图象的清晰度,在新型的投影屏上还装有小型驱动马达,在接通电源启动后,毛玻璃上的麻点当即消除,使图象质量随之增高,这种投影廊称为“高分辨率投影屏”。

投影目镜也是安装在显微照相目镜上,将显微镜所成的象投射在银幕上,它必须在暗室内进行投影,才能在银幕上获得明亮的图象,投影目镜上的棱镜可转动,使图象投射到镜体的前方或后方。由于转动的角度大小,从而使银幕的上部和下部图象变形。因此 ,棱镜应置于90度的位置上,这们投影到银幕上图象的各部分比例才能协调。投影目镜不仅能为更多人观察研究,而且也适用数学,同时也可利用它把图象投射到绘图纸上,进行教学挂图的绘制服。

第五节共览装置

共览装置有多种,最简单老式的为“双人指示目镜”,其中装有一个棱镜,光线既能垂直又能折射,利用折射的光线安装一目镜,而达到两人同时观察的目的。此外,在视场光?平面处装有一个能自由移动的指针,这样可以利用指针指着目的物进行观察研究。新型的研究用显微镜的共览装置则和上述有很大区别,它不仅可供2—5人(有的可供9人)一起使用,而且都为双目观察,每人眼睛的屈光度都可调节。在主览的镜筒中装有可移动的指针或指示箭头,当指到被检物体的某一结构时,所有观察者可同时观察。由于设计和结构精密,镜象亮度甚佳,同时目镜多为广视场目镜,视场亦大,每人之间有着适当的距离,操作时无不便之感。

第三章 显微照相术

在生物科学的研究中,镜检的结果除文字的描述外,显微照相能客观而生动记录下生物的细微结构或形态,它常与生物绘图技术配合,起到相辅相成的作用。

显微照相术又称“显微摄影术”,是将显微镜视场中的微观物体记录为放大的图象。不言而喻,要掌握好显微照相技术,必须在前两篇的基础上,才能对其原理与操作有全面的了解。

第一节不同类型的显微照相装置及其功能

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显微照相的装置种类甚多,从帧幅的大小,可分为135型、??????型几种:从控制系统的操作,可分为自控、半自控及全自动控制三种类型。135型操作方便,感光处片每卷可拍36张(有的为24张),在全自动显微照相系统中,还可在相机上安装250后背、则可拍250帧。???????大帧幅照片操作时则较麻烦,但它拍出照片的细微结构的清晰度则优于135型。

从控制系统来看,手拉式较难于掌握曝光时间,半自控则可测出准确的曝光时间以及光源的色温,但仍不满足多功能的要求,高级的显微照相拍摄系统为全自动控制,功种齐全,是研究显微镜的理想显微照相装置。

第二节显微照相对物镜、目镜及聚光镜的选择 一、物镜的选择

消色差物镜不适用于显微照相,它本身会引起视场图象的边缘焦点不实,而呈现模糊的现象。平场物镜就可获得视场清晰而平坦的图象,所以在显微照相时,必须选用平场消色差物镜和平场复消色差物镜。不仅如此,显微照片的细微结构和层次的优劣,也取决于物镜的分辨率。

在进行高倍干燥系物镜的显微照相时,最好采用带校正环物镜,因高倍干燥系物镜的成象质量与盖玻片的标准厚度有关,盖玻片的厚度不符合标准,将造成复盖差而影响显微照相的质量。在暗场、透射式荧光及油浸显微照相时,应选用带虹彩光?的物镜,借调节光?的大小,达到最佳的图象对比度。有些被检物体不能应用盖玻片,应选用无罩物镜。另外在进行油浸荧光显微旬照相时,应使用无荧光油。

二、目镜的选择

观察目镜是不能用作显微照相,必须使用照相目镜,它的作用是为物镜的象差作光学补偿,使投射到感光片上图象四周与中心都尽可能在一焦点平面上。因此,应有和原配置的照相目镜。

三、聚光镜的选择与孔径光?的应用 聚光镜在显微照相术上的作用很大,它不仅是将光源投射来的光有效地聚焦到被检物体上,更重要的是产生与物镜相适应的光束使图象的反差和焦深处在最佳状态,这些条件的获得,是以调节聚光镜的孔径光?从而使聚光镜的数值孔径与所用物镜数值孔径达到对应关系。前已述及,以观察时聚镜光的数值孔径就应与物镜一致或稍大一些;而在显微照相时,大多数的被检物体,如想得到高质量的照片,孔径光阑要调节在物镜数值孔径的60—80%之间,也即是缩去40—20%,至于缩去多少,要根据图象的反差而定。大了整个照片反差降低,小了图象的分辨率将受到影响,缩小的计算方法甚为简便,例如用数值孔为0。25的10倍物镜,使孔径光阑缩小到80%,则:0。25╳80%=0。20,这时应将聚光镜上标明数值孔径刻度的标记放在0。2的位置上,如若聚光镜的外方没有刻度,可以在聚焦后取下一目镜,用眼观察镜筒,边看物镜的后焦点平面,边用手调节孔径光阑调到约60—80%即可。

三、显微照相的照明装置

显微照相的照明装置有透射式及落射式照明,为了获得均匀的照明效果,应采用柯勒照明法。

第三节照相的程序

一、摄影装置的组装的和调试

仔细按说明安装,一般是把大型照相机安装在支持架上;小型照相机则直接安装在镜筒的上端。

把照相机装上显微镜之后,就可进行下列各个步骤:

1、显微镜的物镜须用遮光套挡住外来的光线,特别是低倍物镜,因与标本之间的距离

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大而更加需要;

2、光源必须对准照相机焦点平面的中心,否则在感光片上产生不均匀的照明; 3、用放大镜仔细检查放映在毛玻璃上的物象是否清晰,焦点是否对准了;

4、将暗箱中的平面反射击镜义务兵下与毛玻璃片平行,将暗盒上的挡光板抽出,让光线直接射到装感光片的暗盒上,即可曝光; 5、加适当的滤光片,以增加底片的反差;

6、进行曝光。曝光所需的时间,可依照1、2、4、8、16、32等比例来试拍,底片冲出后,正确的曝光时间就可确定;全自动摄影装置可自行控制曝光时间。 7、每次曝光之前,都须重行调整焦点。 二、感光片的选择

(一)感光片的种类及其用途

照相机用的感光片分别为两大类:即硬片(干片)和软片(胶片)。硬片是在玻璃片上涂以感光乳剂膜所成,为散页的,适用于大型照相机,装入底片的暗盒后,平整而不收缩。软片是在透明的赛璐片基上涂以感光乳剂制成,为成卷的,适用小型照相机。

在感光片的制造过程中,由于在乳剂中加入的色素不同又分无色片、分色片及全色片三种。

1、无色片:在无色片上涂的感光膜为溴化银及少量碘化银的混合剂,未加入色素,只能感受光谱中的蓝紫二色,对其它色素都不能感光,由于它的感光性能低,不适用于一般照相。但却适用于黑白二色反差强的物体,如翻照书籍、图表、幻灯透明片等,照后黑白分明,非常醒目。

2、分色片:分色片是加入色素的感光片,能感受紫、蓝、黄绿四色。但对红色不能感受,照后均成黑色。由于它对黄、绿色感受性强,故适宜照自然界中富于这种色彩的物体,如风景、运动等。

3、全色片:这种感光片能感受光谱中人眼能见的各种色彩,所以叫做全色片。因有能吸收红色的色素,所以其感受能力比分色片高。拍摄多色物体后,各种深浅色调皆可层次分明。用途也最广。这种感光片适于显微镜照相用,其中以中速和低速全色片更为适宜。

(二)感光片的选择与保存

1、大型照相机选用硬片,小型照相机可选用软片。

2、感光片的速度分高速、中速、最低速四级。高速度的乳剂的银粒粗,低速的银粒细。小型照相机所拍的底片全需要放大,所以应选用银粒细的底片。

3、感光慢的,需要的曝光时间长,但反差明晰,感光快的,曝光时间要短,但反差不明晰。一般以中速或低速的胶片为好。“定”17度胶片较适用于显微照相,如度数增加或减少三度,速度便高或低一倍,如“定”20度比17度快一倍。

4、普通全色片:可用适当颜色滤光片以增强反差。例如用绿色滤光片可使标本的红色部分更接近黑色,用蓝色滤光片可增加它的反差。 5、在暗室中可用下列方法检定干片的乳胶面:

1)有特殊记号者,缺刻在右上角时,即乳胶面向上。 2)无记号者可用唇试这,有胶粘着的一面即为乳胶面。

6、感光片的包皮或盒外印有使用限期的年月,购时须注意。但过期不长,仍能使用。 7、在保存感光时,应注意防潮防热。 三、滤光片的选择

显微照相质量的优劣与影象的反差有密切的关系。如果所照的标本之间反差增强,则显示的结构就明晰,若反差不足,则结果就差。影象反差不足的原因有二:即1)标本在视野以外,被照明部分散射的光线太多;2)集光器的光阑比物镜所能容许的为大。如欲校正这

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