斑马鱼胚胎发育的分期 - 图文

温度与标准发育时间

对活体胚胎进行分期总是比将其致死和固定后再分期要好。例如在伸直和孵化期间的分期需要对头部大小和卵黄质量进行对比，而固定期间会造成不同程度的收缩而破坏了正常的关系。然而，如果保存良好，我们可以利用其他标准相对可靠地对固定或完全包埋的胚胎进行分期，但切割后则不易分期。

成像

所附图片均为活体胚胎，后期为麻醉处理。原始图片被制作为彩色幻灯片（柯达 Ektachrome 160T DX），而黑白插图由中间底片复制而成。彩色幻灯片可付费向作者索取。显示整个胚胎的低倍图像由Zeiss STEMI立体显微镜获得：将胚胎置于凹槽载片的标准介质中，而不需要盖玻片，介质中含有1.5-3%甲基纤维素（methyl cellulose）以利于预期定位。显示部分胚胎的高倍图像由Nomarski光学系统（通常配合Zeiss 40×浸水物镜）摄得，使用Zeiss UEM组合显微镜。将胚胎包埋于盖玻片之间，有时加1%琼脂以固定。

温度与标准发育时间

我们将分期信息转换为“标准发育时间”，用字母h表示，定义为在28.5℃这一适宜温度孵育下受精后的小时数。孵育在其它温度下会改变发育速度，而这在特定研究中可能会有用。例如，使两个胚胎在某一时间达到不同的分期以作异时移植。对孵育于不同温度下的胚胎进行对比须谨慎进行，因为不能保证当温度变化时胚胎所有特性均随发育速度作同步变化。然而，若是将胚胎保存在25-33℃范围内，其发育似乎正常，超出这一范围温度作长时间孵育将出现异常。图2显示了在极值点的发育速率，图右侧的说明提供了一个简单的公式可用以估算出这一范围内的任一温度下胚胎发育所能达到的某一分期。

图 2 . 孵育于25℃和33℃的胚胎孵育速度。A：尾芽期，B：突口期。纵轴为28.5℃标准温度下孵育的分期。可以想象，28.5℃下的发育曲线为通过原点的直线，斜率1.0。注意到25℃和33℃下的发育曲线均为直线，且斜率在两图中几乎相同。因此发育速度随孵育温度而变化，可用以下公式估算任一温度下达到某分期所需发育时间：HT =h/(0.055T-0.57). HT为T温度下的发育时间，h是在28.5℃下达到某分期所需时间（见表1）。分期缩写：c: cell, d: dome, s: shield, b: bud; s: somite, p: prim, hp: high-pec, lp: long-pec, pf: pec-fin, pm: protruding-mouth. 方法：对自然产卵形成的胚胎进行观察，分3组，每组20-30个胚胎，孵育于150ml大烧杯。用多项指标确定分期，并确保取出观察的胚胎与保留在烧瓶中的无发育差异。因为吹打、去绒膜、麻醉等处理会显著阻滞发育，如此处理的胚胎比长胸鳍期的对照

组晚2-6小时。 8

斑马鱼胚胎发育的分期

合子期（0-0.75h）

新受精的卵子直至其第一次卵裂发生，称合子期（图3），约受精后40分钟。受精时形成的合子直径约0.7mm。合子期只含有一个分期，但其间也发生很多变化，可以很容易划分这一时期（见Hisaoka and Battle,1958）。

合子期的分期

1-细胞期（0 h）.绒膜膨胀并脱离新受精的卵子（图3A）。受精同时也活化胞质运动，约10分钟内很容易看到。非卵黄胞质开始向动物极流动，促使胚盘和卵黄颗粒丰富的植物极胞质分离（图3B）。这一分离在卵裂早期仍在继续。

分离进入动物极。比例尺=250μm

图 3 . 合子期。A：受精后数分钟，绒膜膨胀。B：受精后约10分钟，动物极朝上的去绒膜合子。非卵黄胞质开始

卵裂期（0.75-2.25h）

首次卵裂形成的两个细胞，或称卵裂球在间隔15分钟后分开（图4，5）。胞质分裂为部分分裂，只是在胚盘底部不完全切开，卵裂球仍通过胞质桥结构相连。这一时期的6次卵裂通常按规则的方向方向发生，因而我们可以通过卵裂球的排列知道其数目，而不必一一计数。

这一时期和下一时期的早期都可用Nomarski光镜划分每细胞周期以实现精确分期。胚盘中所有细胞都同时或近似同时地完成细胞周期。约在细胞周期的前半部分，即细胞间期，细胞核存在且可见，核形态也发生系统性变化（见下，图10）。每个早间期细胞核都是球形的，晚间期为类球体，其后随细胞进入有丝分裂，核逐渐变为椭球体，直至有丝分裂前期消失。椭球体的长轴指示了随后卵裂的取向。有丝分裂期的染色体很难看到。近有丝分裂晚期，在胞质分裂之前，卵裂球形状变得更圆。

卵裂期的分期

2-细胞期（3/4 h）.结束第一个合子细胞周期的首次卵裂形成的卵裂沟是垂直的，一直到32-细胞期都是如此。卵裂沟在近动物极形成，迅速向植物极伸长，只经过胚盘区域而不经过卵黄区域（图4A）。在近于胚盘底部，卵裂沟变为水平方向，以Wilson（1889）最早描述的黑鲈（sea bass）那种方式切割胚盘，但仍只是部分与底下的卵黄区域分开。形成的两个卵裂球体积相同，似乎不易相互区分。

随后的几次分裂严格按第一次分裂的方向进行，然而最终的身体对称轴（即背腹轴和前后轴）似乎并不能完全由卵裂方向决定（Kimmel and Warga, 1987; Abdelilah等, 1994; Helde 等, 1994），而有些报道则认为可以（Strehlow and Gilbert, 1993; Strehlow等, 1994）。

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卵裂期（0.75-2.25h）

4-细胞期（1 h）.两个卵裂球不完全裂开（图4B），裂平面以合适角度穿过动物极和第一次卵裂面。因而第三细胞周期开始于2×2排列的4个卵裂球。从动物极看（见图6）胚盘呈椭球体，而第二次卵裂面是沿长轴方向的。

图 4 . 卵裂期胚胎。除B外均为正面观，B显示的是胚胎在动-植物极的扭曲，约偏离正面45°。 A :2-细胞期（0.75 h）；B：4-细胞期（1 h）；C：8-细胞期（1.25 h）；D：16-细胞期(1.5 h)；E：32-细胞期（1.75 h）；F：64-细胞期（2 h）。比例尺=250μm

图 6. 动物极观，前5次卵裂平面示意图。外圈为卵图 5 . 受精后（在28.5℃），卵裂球数目随时间变化的理想曲线，此段时间卵裂发生较为同步，在第10细胞周期的囊胚中期转变之前。 黄，A内部椭圆为未分裂的胚盘。B-F为连续的卵裂，奇数次卵裂沿短轴切割胚盘，偶数次卵裂沿长轴切割胚盘。引自Kimmel 等 (1991)，经Wiley & Sons子公司Wiley-Liss John Inc惠允。 10

斑马鱼胚胎发育的分期

8-细胞期（1.25 h）.卵裂发生于第3细胞周期结束，仍为不完全卵裂。两个独立的卵裂面与第1次卵裂面平行，将胚盘切割为2×4排列的卵裂球。由于去绒膜胚胎通常侧躺于培养皿，其4-细胞面（而非2-细胞面）正对观察者。此“正面”观（Kimmel and Law, 1985a）沿奇数卵裂面（卵裂沟1和3可见，图7）。一直到囊胚晚期去绒膜胚胎总倾向于以此方向平展开，图1第一部分（到高囊胚期）、图4（4B除外）和图7均为此“正面”观所得。

16-细胞期（1.5 h）.第4组卵裂同样沿两个面进行，均与第2次卵裂面平行，产生4×4排列的细胞，须小心与8-细胞期鉴别，因为其正面观很相似（图4C,D）。

第一次出现部分细胞完全与其他细胞分离，这些细胞是位于最中心处的4个卵裂球。此四分体在图6E中完全被其他细胞包绕。全分裂发生于近16-细胞期末，因为此次卵裂沟先从胚盘中心底部切开，再向外围延伸。实际上，作底部切开的卵裂沟并未到达外围，包围此四细胞的12个细胞（称外围卵裂球）仍与卵黄细胞通过胞质桥相连（Kimmel and Law, 1985a）。此分期之后直到囊胚中期，每次卵裂均能完全或大部分分离非外围卵裂细胞，仍不能完全分离外围卵裂细胞。

图 7. 卵裂期正面观显微扫描示意图，显示从4-细胞期一直到64-细胞期卵裂球的世系关系。各卵裂球根据期世系标号，同时也指出其位置。每一标号代表胚胎中的两个细胞，其中一个在图中可见，而另一个须将胚胎沿动-植物极轴旋转180°才可看到（比如，此处在4-细胞期只显示2个细胞）。在4-细胞期，细胞L处于第1次卵裂面左侧，细胞R处于右侧（因此，这里的标号L和R并非指未来胚体的左右侧；见正文）。细胞L分裂产生L1（更靠近动物极）和L2。L1分裂产生L11（更靠近动物极）和L12，如此等等。对于64-细胞期，深层细胞没有绘出。 引自Kimmel and Law (1985a)，经由Academic Press惠允。

32-细胞期（1.75 h）.第5细胞周期结束时的卵裂通常发生于四个平行面，而不是位于第1和3卵裂面之间两个平面。然而此时，斜向卵裂沟很明显。通常32细胞呈4×8排列，但除规则排列之外，不规则

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