由此改变了这一系统活性的蛋白质来完成。
生物谷推荐的英文原文SnapShot： CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems
阶段2：crRNA合成
CRISPR RNA生物合成在转录之后，生成初级转录产物：pre-crRNA，之后经过加工，又成为一组短小的CRISPR 衍生RNAs（crRNAs），这些crRNAs每一个都包含有对应于之前遇到的外源DNA的对应序列。
CrRNAs导向序列两端是相邻重复序列区域，在I型和II型系统中，这种CRISPR转录产物会被CRISPR特异性核酸内切酶（Cas6 或 Cas5d）切割，切割位点位于重新序列。许多I型系统的重新序列会出现多次，因此Cas6也需要稳定连接在crRNA 3’端茎环上。对于III型系统来说，Cas6则是短暂连接，crRNA 3’端会进一步通过未知的酶处理。
II型系统中，CRISPR RNA加工过程则取决于反式作用 crRNA (tracrRNA)，tracrRNA包含一个重复序列的互补序列，这些双螺旋区域在Cas9出现时可以通过RNase III 进行处理。
相关论文解析：CRISPR-mediated adaptive immune systems in bacteria and archaea.
这篇发表在Annu. Rev. Biochem. 杂志上的文章十分重要，解析了crRNA合成过程，以及其后的靶向干扰中的几个重要步骤，此后也被多人引用。
Development and applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering
张锋的这篇综述概述了CRISPR/Cas9作为一种平台技术的开发状况以及在基因组编辑方面的应用，也讨论了其存在的一些挑战，以及未来的创新之路。
阶段3：靶向干扰
成熟的crRNAs能指导Cas蛋白靶向互补靶标，靶标序列由专用Cas核酸酶降解，但其靶标降解的机制存在差异。I型和II型系统都可以靶向包含PAM和protospacer互补序列的dsDNA底物。III型系统则不依赖于 PAM作为识别序列，而是通过导向序列延伸至crRNA信号5'handle的核苷酸进行识别（CRISPR位点包含与导向序列，5'handle互补的序列），并阻止靶向切割。
相关论文解析：Co-transcriptional DNA and RNA Cleavage during Type III CRISPR-Cas Immunity
一些数据表明，当病毒入侵细菌细胞时，称作为III型CRISPR-Cas的这一机制会靶向病毒的DNA，阻止它利用细菌的机器来拷贝自身及感染更多的细菌。但另外的一些实验表明，III型CRISPR-Cas只能通过切割病毒RNA来让病毒丧失能力。
洛克菲勒大学的研究人员他们检测了III型CRISPR-Cas对DNA和RNA的切割，结果发现了从前其他人没有得到过的一个关键成分，并发现CRISPR-Cas确实切割了病毒DNA生成的RNA，但它也切割了病毒的DNA。
这种双交叉系统有一些优势。许多的病毒整合到它们感染细胞的基因组中保持休眠状态，不会造成损伤。事实上，这些病毒对于细菌可能是有益的，例如它们携带的毒素帮助了细菌促进自身生存。举例说来，白喉毒素是由一种细菌所分泌，但编码这一毒素的基因却来自于一种病毒。只有在病毒开始将它们的DNA转录为RNA之时才会让它们丧失功能，通过设置这样的要求III型CRISPR-Cas不会损及休眠病毒，使得它们可以继续让宿主细菌受益。
循环关闭
I型系统中，监测复合物中靶向结合会导致Cas3介导的靶向降解（直接干扰）或最初采集，这其中涉及crRNA导向募集Cas3、Cas1 和Cas2到外源DNA处，引起新一轮的快
速采集。
II型系统中虽然未观察到最初采集，但Cas9 也是protospacer筛选的必要元件，这表明在靶向干扰与外源DNA采集之间存在一种功能性联系。近期还有研究发现了编码anti-CRISPRs 蛋白的不同病毒基因，指出了干扰以上不同阶段，能颠覆CRISPRs 系统。
Cas9 specifies functional viral targets during CRISPR-Cas adaptation.
一些证据表明，某些Cas酶（未包括Cas9）自身可以操控记忆形成过程。基于Cas9识别切割位点的方式，研究人员猜测Cas9在记忆形成中也发挥了作用。
除了匹配CRISPR引导序列和病毒DNA，Cas9需要在附近寻找第二信号：病毒DNA中的前间区序列邻近基序( protospacer adjacent motif，PAM)序列。这是一个至关重要的步骤，因为PAM序列的存在阻止了Cas9攻击细菌自身包含记忆的DNA。
为了检验他们的假说，研究人员交换了化脓链球菌和嗜热链球菌免疫系统的Cas9酶，它们各自识别不同的PAM序列。结果，PAM序列跟随着在两种细菌之间发生了交换——表明在记忆形成中Cas9负责了PAM的识别。
Multiple mechanisms for CRISPR–Cas inhibition by anti-CRISPR proteins
实验操作
1、根据靶序列设计 RNA 序列；
设计sgRNA，提供的序列经过blast，优选脱靶效应最低，此外，为进一步提高sgRNA的特异性和降低脱靶效应，提供双切口sgRNA对设计（Figure1）。
Figure 1.Schematic illustrating DNA double-strandedbreaks using a pair of sgRNAs guiding Cas9 D10Anickases (Cas9n).
2、sgRNA表达载体构建，或sgRNA体外转录合成
A、sgRNA表达载体构建（试剂盒Precut SgRNA Cloning kit &pSD-gRNA Plasmid）
质粒pSD-gRNA 专门用于在哺乳动物细胞中表达sgRNA，该质粒含CMV 启动子驱动的GFP 报告基因表达框，与Cas9表达质粒一起转染细胞即可以完成基因组编辑功能。此质粒含氨苄抗性用于阳性克隆筛选，试剂盒提供预剪切线性质粒，可以直接进行连接筛选阳性克隆，降低了酶切质粒不完全导致假阳性克隆的出现几率。 B、sgRNA体外合成。
sgRNA合成纯化试剂盒（T7 sgRNAMICscriptTMKIT&EzOmicsTMRNA QUICK clear KIT）体外转录的sgRNA与质粒表达的sgRNA相比，更简便快捷，省去了质粒构建的步骤，整个操作过程仅需20h（包括过夜孵育）。转录纯化后的sgRNA可直接进行转染及细胞显微注射。 （1）sgRNA合成引物（反向引物设计为固定模式） （2）PCR kit（e.g. pfu DNA polymerase） （3）T7 sgRNAMICscriptTM KIT
（4）EzOmicsTM RNA QUICK clear KIT-------一步纯化RNA 转录产物
简单三步实现sgRNA轻松合成
3、全基因组sgRNA文库的构建（用于全基因范围的基因打靶，构建突变体库） （1）根据物种信息，进行生物信息统计
（2）针对物种的全基因组进行 RNA 序列设计
（3）根据设计结果合成 RNA 或构建sgRNA表达载体库
（4）sgRNA表达质粒和合成的RNA 文库，质粒及RNA 质量分析报告。
4、CRISPR/Cas9 载体
有多种cas9 表达载体及其sgRNA共表达载体，三种不同的突变用于不同的应用，例如双切口敲除、单切口敲除、抑制转录、启动子激活等。
5、sgRNA活性检测
包括SSA luciferase 报告系统、Surveyor 法、Q-PCR、突变点基因测序等 （1） SSA 检测：根据要求检测sgRNA的活性及敲除效率，也可以选购
BiomicsPrecutpSG-target Cloning kit 自行构建报告载体用于检测，提供阳性及阴性sgRNA及其SSA report target 质粒。
检测原理：SSA 报告质粒(pSG-target)中luciferase 基因被终止密码子提前终止，这种截短的luciferase 没有活性。为检测sgRNA的剪切活性，将Cas9/sgRNA的靶点序列插入到终止密码子之后。在Cas9 和sgRNA的作用下，靶点位置的序列被有效剪切形成DSB，细胞通过同源重组重新形成有活性的luciferase（Figure 2），通过检测luciferase 的活性升高就可以反应Cas9/sgRNA的剪切活性（Figure 3）。
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