操作步骤
（一） 蛋白样品制备
（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、 倒掉培养液，将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液，（暂不作可将培养皿存于-80度）。 2、 向培养皿中加入裂解液，通常6孔板150-200ul/孔，12孔板50-60ul/孔，冰上放置，摇床20min 3、 用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5ml离心管中，勺子在处理不同样本前清水洗净、擦干（注意冰上操作）
4、 超声处理（可选）注意蛋白悬液放于冰上，15sec处理，duty cycle 50-60 每次处理后清水洗探头、擦干，再作下一个 5、 于4℃下12000rpm离心5min。
6、 将离心后的上清分装转移倒1.5min的离心管中放于-80℃保存。 （2） 组织中总蛋白的提取：
1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（5ml离心管）。 2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于冰上。 3.10，000g ,4℃,10min,（5ml管） 4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4℃,60min, 5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
（二） 蛋白含量的测定
1、 从-20℃取出1mg/mlBSA，室温融化后，备用。
2、 取7个5ml离心管，分别加入1mg/mlBSA:0、10、20、40、60、80、100ul，用蒸馏水补足各管至100ul。
3、样本取5ul，加蒸馏水95ul，使总量亦为100ul，混匀。 4、各管加G-250溶液2ml混匀，室温静止2分钟。
5、混匀后，在生物分光光度计上比色分析，测定595nm的光吸收，测定时浓度由低到高。 6、于Excel根据标准品绘制标准曲线，根据得出的公式计算样本浓度。
（三） SDS－PAGE电泳
（1） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。 （2） 灌胶与上样
1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边）
2、 按前面方法配10％下层胶（15ml，两块胶，每块胶在6.5 ml左右），加入TEMED后立即摇匀
即可灌胶。 灌胶后胶上加一层正丁醇（1ml左右），液封后的胶凝的更快。
3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。弃去正丁醇，用水冲洗，并用吸水纸将水
吸干。
4、 等待胶凝期间可计算含50-100ug蛋白的溶液体积即为上样量（根据自己的实验需要进行选
择，没有固定的量），目的蛋白GluT3一般在20-30μl左右。
取出上样样品至200μl的EP管中，加入4×上样缓冲液及DTT至终浓度均为1×（上样总体积一般不超过30μl）。上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性（亦可以使用PCR仪进行变性，加快速度，这样就不用将水煮沸了）。
5、 按前面方法配5％的上层胶（6ml，两块胶）,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小（也提示胶已经凝固），从而使加样孔的上样体积减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。 等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。
6、加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
*电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的上缘（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。
7、上样 (注意：最外两泳道易跑歪，尽量不用。)
Marker 6μl （Marker加在最边上的加样孔中） 样本 20-30μl
实验所用Marker电泳后出现10条带：10，15，25，35，40，55，70，100，130，170KDa （3） 电泳：电压100V，电流300mA,功率50W，时间1.5hour。(电泳15分钟后可调节电压到130V) 电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好）。 电泳结束前20分钟配制1X转膜缓冲液。
（四） 转膜
（1） 转一张膜需准备4张滤纸和1张硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套（因为手上的蛋白会污染膜）。将切好的硝酸纤维素膜和滤纸置于1X转模缓冲液浸湿。
（2）夹子黑的一面：海绵-2张滤纸-胶-NC膜-2张滤纸-海绵
将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫二层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）
先将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻刮去，小心剥下下层胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将硝酸纤维素膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖2张滤纸并除去气泡（膜盖下后不可再移动）。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。 整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
如果同时做两块胶，转膜的时候应记住样本的位置。
（3） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用100V转移1.5h。
? 实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两
块硝纤膜，以免转膜过头，因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，一般80-100V，时间也要延长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4度下12V转膜过夜；
? 硝纤膜建议使用0.22μ的小孔径膜，不容易转膜过头；
? 不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件； ? 转膜时电极方向注意是膜正胶负。
如果同时做两块胶，转膜结束应在膜上做标记，以便查询相应样本。 转膜结束前配制封闭液（5%脱脂牛奶)及1X TBST缓冲液。 （五） 免疫反应
（1） 封闭：将膜用移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。 （2） 一抗
a. 用parafilm膜制作与膜大小相同的槽； b. 从封闭液中取出膜，1X TBST 5minX3次;
c. 将一抗用封闭液稀释至适当浓度（目的蛋白GluT3 1:300, actin 1:2000）；
d.将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体，室温下孵育1-2h后（目的蛋白GluT3 1.5h,actin 1h），4度过夜， 次日用1X TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。 （3） 二抗
同上方法准备二抗稀释液（目的蛋白GluT3 1:1000,actin 1:1000）并与膜接触，室温下孵育1h后，用1X TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。 （六） 化学发光，显影，定影
（1） 将A和B两种试剂等量（常用各500μl）在5ml离心管中等体积混合；
打开X-光片夹，铺上保鲜膜，将NC膜面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1-3min后（见到荧光），用保鲜膜包好。
（2） 将1×显影液，自来水和定影液分别到入盘中；
在红灯下
? 取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；把X－光片放在
膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min到5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果； ? 曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条
带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；
? 显影结束后，先用自来水洗一下X-光片，然后再放到定影液中进行定影（这样可以
延长定影液使用时间，从而节约定影液）。定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；
（七） 凝胶图象分析：将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
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