微生物标本采集、运送及管理

微生物标本采集、运送及管理

来源:17baba.com时间:2007-10-08 字体:[大 中 小] 收藏 我要投稿

文章出处：朱敏 转载请注明出处 血液

血液是实验室所接收的最重要的标本之一。送检血液标本有助于识别由细菌、真菌引起的菌血症、脓毒血症、心内膜炎及人工瓣膜感染、化脓性血栓性静脉炎、以及其它感染或导管引起的感染（vascular grafts）.因为大量的各种微生物与血源性感染有关，所以用于血培养的培养基应该能广泛支持各种细菌的生长。所幸的是在过去的十多年间，已经发展出许多用作血培养的改进的培养基及技术，产生出了高度可靠的手工血培养基和自动化血液培养系统。 血标本量，采血时机，及采血量

对于成人患者，每次发热时应该分别在两个部位采集血标本以帮助我们区分是病原菌还是污染菌，特别是对于凝固酶阴性的葡萄球菌、棒状杆菌、viridans链球菌、以及布鲁氏菌要考虑其污染的可能性。一般来说，单一采集的血培养标本更可能被污染，而要检出具有代表性的病原体则往往要在两个以上部位采集两份以上的血作培养。在24h内采血部位不得多于4个以上。此限制考虑到一天中每次发热时只采集2个部位的血作2份血培养就可评价2次发热。作再多的血培养都没有必要。根据几份研究资料表明，95%以上的菌血症都是在头2、3份血培养中检测出来的。

采集血标本应该在使用抗生素之前，尽管有些培养基含有消除抗生素影响的物质。理论上说，采血时机应恰好在发热高峰之前；而实际上应该是在发热高峰后立即采血。采血的总量也是影响检出病原体的重要因素之一。在一项研究中，增加血培养的血量从40ml到60ml可提高检出率10%。对于成人，每次穿刺应采血20～30ml，。对于儿童的采血量就要求少一些，因为其每毫升中的细菌要多些。血与肉汤的比例以1:5～1:10更有利于检出细菌，这或许是肉汤稀释了抑菌物质的缘故。大多数商业血培养系统为了最佳检出，都规定了必要的血标本量。对于标本量不足的血培养标本不必拒收，除非使用的是Isolator system。应定时举办讲座，向临床讲解最佳血培养技术。 初步处理

血培养标本的初步处理需要视所用的培养系统而定。送检的血培养瓶应放于室温待处理。对于一些连续监测系统，培养瓶需要用针通气或将附件插在瓶顶用于压力测定，等等。 直接法

我们不推荐血标本直接作Gram染色，因为通常血流中的细菌太少。一旦检测到有细菌生长就应该取培养瓶的肉汤或培养瓶固相琼脂的细菌作Gram染色。Gram染色报告应该详尽描述以便于选择适当的抗生素。例如，排列的Gram阳性球菌应该作出描述，i.e.,成对的，簇状的，或链状的；而Gram阴性杆菌时，有描述为细小或球杆状的。

当怀疑阳性肉汤中为金黄色葡萄球菌时，要直接作一个?2-h凝固酶试管法实验?，以快速作出鉴定。有各种资料表明，有些商业鉴定板条能够直接用阳性肉汤接种鉴定出Gram阴性菌。 血培养系统

（略） 培养条件

所有的血培养温度都应在35℃。手工血培养系统应该培养7天。只有肉汤的手工需氧培养瓶要在最后一天作传代培养。对于自动化系统，培养5天就足以检出绝大多数细菌。此外，采用这样的培养时间限制，几乎没有发现污染。对于自动化的血培养不必转种作传代培养。当转种阳性瓶时，所选择的需氧培养基要根据Gram染色涂片的镜下结果。如果Gram染色镜下所见细菌形态提示可能为厌氧菌或者只从厌氧血培养瓶中检出细菌，转种时就要选择厌氧培养基及厌氧条件。 特别考虑的问题 厌氧菌

血液检出厌氧菌的机会很少。在过去几年，一些研究表明血液中厌氧菌的感染呈下降趋势。但是并非所有医院都如此。因此，实验室应该回顾自己的数据以决定是否将厌氧菌的血培养作为常规检查项目。手工血培养瓶/系统不宜用于培养厌氧菌。自动化系统的厌氧培养基足以用于厌氧菌的培养，尽管这些仪器设备的功能还不是十分完美。 苛养菌

有些可引起血液感染的细菌用常规的血培养方法不能检出。布鲁氏菌可生长在常规培养基中；然而，虽然这些菌最少可在3天检出，但是还是建议培养保持21天；而且在某些情况下最后还是需要转种作次培养。HACEK菌群（Haemophilus aphrophilis,Actinobacillus actinomycetemcomitans,Cardiobacterium hominis,Eikenella corrodens,and Kingella

kingae）与细菌性心内膜炎有关，也可从常规培养基中培养出，但是需要培养至14天，并且最后需要转种培养。当临床病史提示有弗朗西斯菌感染，阳性培养瓶还需要再另外转种一份到BCYE琼脂，而且所有操作都要在3级层流生物安全柜中按安全规定进行。钩端螺旋体不能在常规培养基中检出。在钩端螺旋体感染发病的第一周采集1～２滴血，应该接种在半固体培养基，如Fletcher?s Ellinghausen-McCullough/Johmson-Harris,或者是Polysorbate 80.培养基，应于室温下培养至6周。

在血液中要发现Bartonella henselae（一种巴尔通体）很困难，但是在某些培养系统则可以培养出来。用Isolator system 时应将处理过的血标本接种在营养加强的血琼脂或巧克力琼脂上，35℃，在提高二氧化碳含量及湿润环境下培养至4周。采用Septi-Chek system 时，Bartonella henselae可以生长，但是要培养到40天。采用只有肉汤的血培养系统培养这种病原体时，可将肉汤涂片，用吖啶橙染色可以观察得到菌体。而这种病原体不会使肉汤浑浊，产生的二氧化碳量也不足以能够被仪器设备检测出来。 分支杆菌

在过去几年中，分支杆菌在HIV患者中越来越多地出现感染流行。这些细菌一般不会在血培养中检出。 导管头

导管头的培养是为了确定菌血症的感染源。最常用的方法为半定量法 ，此法是用５cm长的导管远端部分在血琼脂平板上反复涂抹４遍。经培养产生的菌落数要＞15个才有意义，才能认为存在导管引起感染的可能性。

另外，也已有许多其它用于鉴别是否为导管引起感染的技术报道。……。但是，至今还没有一个最佳实验室方法。因为大多数这类感染有严重的临床表现，普通血培养就可以确定哪个患者需要治疗。 无菌体液 脑脊液

脑脊液标本是用于诊断脑膜炎。细菌性脑膜炎又分为急性和慢性。急性脑膜炎，在症状发作的前24h内，通常由化脓性细菌引起。可能引起感染的病原体要根据患者的年龄以及区分是院外感染还是院内感染。典型的细菌感染主要引起慢性脑膜炎，其症状至少持续了4周，病原体包括有结核分支杆菌，梅毒螺旋体，布鲁氏菌，问号钩端螺旋体，以及博氏疏螺旋体。 CSF通常是经腰椎穿刺采集。每份细菌学检验至少需要0.5ml CSF，当然量多一点会更好。标本应该立即送往实验室并尽快处理。如果不能及时送检，标本应置于室温下。

如果采集的CSF多于1.0ml，应该离心至少1500 X g 15分钟。上清液倾入无菌试管中，留取0.5ml的沉淀和液体，充分混匀，涂片镜检和接种平板培养基作培养。另外，成倍多的标本可采用细胞分离制备标本。

在实验室所有的CSF标本都要作Gram染色。其结果，包括微生物及所见细胞成分的描述和计数都要立即报告给申请医生。快速方法可检测标本中的一些细菌的抗原：B群链球菌、肺炎链球菌、一些脑膜炎奈瑟氏菌的血清型、大肠埃希氏菌（K1囊抗原与脑膜炎奈瑟氏菌B型的有交叉反应），标本离心的上清液或原始标本中可检测到流感嗜血杆菌b型的抗原。据一些研究资料表明，这些快速抗原检测的敏感性与Gram染色的差不多。只是对于一些特殊的脑膜炎，其抗原测定会更敏感一些。另外，研究发现这些快速抗原检测结果对于医生对患者的护理和治疗没有多大的影响。主要原因是这些试验要比 Gram染色贵得多，而且更费事。许多实验室都不再开展这些快速实验或严格限制其使用（如，对于CSF中的白细胞>50时）或需要临床与实验室之间作好协商后。

CSF的培养应该考虑到所用的培养基以及培养条件要适合苛养菌的培养检出。用肉汤培养基没有多大意义。 特殊考虑的问题 厌氧菌

厌氧菌几乎不引起脑膜炎；常规不要求作CSF的厌氧菌培养。但是通常脑脓肿，硬膜下积脓及硬膜外脓肿要作厌氧菌。 分支杆菌

除了对来自源于AIDS患者的CSF要作分支杆菌的检测外，对CSF作分支杆菌检测只考虑以下情况：脑脊液[淋巴]细胞增多，CSF葡萄糖值或蛋白质的值异常。因为分支杆菌在CSF

中的量少，所以作培养的标本量就要大点（3—5ml为好），CSF标本要离心3000到3600 X g 30分钟，到掉上清液，将沉淀用旋涡振荡器充分混匀，准备涂片用于AFB染色并接种于适当的培养基，包括液体培养基。培养条件：35℃、8%的CO2环境，至少6周。 钩端螺旋体

钩端螺旋体可以从发病前10天的CSF中发现。采集标本应该在抗生素使用之前和病人在发热时采集。要直接检测钩端螺旋体时，CSF标本就要以1500хg离心30分钟并取沉淀涂湿片在暗视野显微镜下观察。钩端螺旋体可在半固体培养基上培养，如Fletcher?s培养基，Ellinghausen-McCullough/Johnson-Harris培养基，或Polysorbate 80培养基培养检出。离心沉淀标本建议接种0.5ml。室温下培养至6周。 其它体液

其中包括心包液、胸水、腹水和滑液。对其用于微生物检验的送检标本最好是液体，而不是拭子。1—5ml的量已足够检出大多数病原体。对于非卧床透析患者的腹膜炎诊断要采集最少50ml标本才有利于检出病原体。体液应直接接种于血培养瓶或者在床旁收集于无菌、厌氧容器中并立即送到实验室。

在实验室，1ml以上的标本应该至少以1500хg离心15分钟。弃掉上清液，留取约0.5ml沉淀，混匀，涂片作Gram染色并接种于培养基中。如果要采用细胞离心作涂片，在此之前大约要留取0.5ml标本作细胞离心。未离心标本也可在实验室直接接种于血培养瓶中，留取少量（0.5—1.0ml）作Gram染色。选择用于培养体液的固体培养基要有利于培养苛养菌。只有在培养非卧床慢性患者的腹透液时才有必要接种液体培养基，其腹透液中的细菌很少只有约1CFU/ml。是否需要其它体液接种于液体培养基应该由各实验室自己决定。培养应该在有CO2的环境中，35℃培养。 特殊考虑的问题

用于检验分支杆菌的体液标本的处理不同于检验其它细菌，离心要求为3000到3600хg，30min。弃掉上清液，沉淀用于涂片作AFB染色并接种于相应的培养基。培养条件：35℃，8% CO2，培养至少6周。

体液标本可以用含有抗凝剂的试管送检。抗凝剂有肝素、枸橼酸盐和EDTA，对有些细菌有抑制作用。所以最好还是不要用这种方式。如果要采用抗凝剂，就必须要向申请检验的医生说明其对结果的局限性。 耳部位标本

实验室收到的耳部位标本一般有两种，即用于诊断耳炎的拭子和用于诊断中耳炎的外耳、中耳液体。这两个部位潜在感染的细菌有所不同。铜绿假单胞菌常常引起外耳炎。也会有其它细菌，但不会有厌氧菌，所以没有必要作厌氧菌培养。来自于呼吸道的菌群，包括肺炎链球菌、流感嗜血杆、卡他莫拉氏菌以及金黄色葡萄球菌和G-杆菌都可能引起中耳炎。选择接种的培养基和培养条件要考虑到有利于检出这些病原体。厌氧菌可以引起中耳感染；是否作厌氧菌的培养要根据临床要求。如果送检有足够的中耳液标本，就要涂片作直接检查。其它的耳部标本一般不作直接检查。