微生物标本采集、运送及管理

对于支气管肺泡灌洗液和支气管刷检标本，怀疑为呼吸器相关性肺炎时，应考虑作定量培养以便对分离出的微生物的临床意义作出最佳评估。支气管刷检物，含有大约0.01到0.001ml的分泌物，将其采集后立即放入1ml的无菌盐水或肉汤中，并且立即送到实验室。在实验室用旋涡振荡器将其混匀；细胞离心，涂片作Gram染色直接镜检评估，用无菌微量吸管或标定接种环取0.01ml标本接种于适当的平板培养基。菌落计数大于1000/ml肉汤或盐水（相当于106 CFU/ml原始标本）表明与感染有关。在支气管肺泡灌洗时可以采集到10到100ml液体。取一部分标本送往实验室，作细胞离心涂片及Gram染色。染色报告应当包括描述细胞内是否有细菌。有几项研究表明，在＞7%的细胞内见到含有细菌就认为与呼吸器相关性肺炎有关联。将0.001ml X n倍的标本接种于琼脂培养基上，如果某一特殊细菌菌落计数大于10000/ml标本液体，则认为与肺炎相关。 军团菌属

军团菌引起社区性肺炎和医院获得性肺炎并非罕见.军团菌可以通过培养诊断、通过检测尿液中的抗原或血清学试验进行检测。一般来说培养比较受欢迎，培养可以检测军团菌属的所有种，不象其它的方法受到菌种或血清型的限制。在培养之前，标本应该在肉汤培养基中稀释10倍，例如用?胰蛋白大豆胨?肉汤或无菌水稀释标本中的抑制性物质。因为军团菌生长缓慢，要从高污染的标本，如痰或气管抽吸物，分离军团菌，最好是在接种标本之前对其用酸进行去污染处理。标本用1：10的KCL-HCL缓冲液（PH2.2）稀释并在室温下孵化4min。重要的是孵化不得超过4min，因为军团菌在酸的作用下会慢慢失去活性。然后将标本接种到军团菌琼脂培养基（该培养基不含抗生素），该培养基应该培养于35℃、湿润环境下，至少5天。 肺炎支原体

肺炎支原体是引起非典型肺炎的主要病原体。因为肺炎支原体为苛养性而且生长很缓慢，决定性的诊断常常是基于血清学试验。当要求培养时，一般选择咽拭子；痰和其它呼吸道标本也可接受。标本采集后要立即放入含有蛋白质的运送培养基中，如白蛋白，青霉素可以用于减弱其它污染菌的生长。标本可以在运送培养基中，于4℃保存到48小时或-70℃冰冻更长一段时间。 洋葱假单胞菌

洋葱假单胞菌是患有囊性纤维化疾病患者重要的呼吸道致病菌。此菌在常规培养基中生长良好；但是选择性培养基，例如PC琼脂和OFPBL琼脂用以分离呼吸道分泌物中的洋葱假单胞菌效果会更佳。 衣原体

衣原体也是呼吸道的重要致病菌。沙眼衣原体可引起婴、幼儿的各种呼吸道疾病。肺炎衣原体可在所有年龄段致病，但是大多数严重患病的是幼儿和上了年纪的。鹦鹉热衣原体是动物的病原体但是偶尔也对人类致病。作支原体检验的标本应该放在一种培养基中（其中含有选择性抗生素），为了维持支原体的活性，标本应及时送往实验室，在实验室采用shell vial 技术接种于McCoy或buffalo green monkey 细胞。如果标本在48小时内不能及时处理，应将标本冷藏；如果更长的时间内不能处理，标本就得放入-70℃或更低温度。具体检验方法见有关章节。

奴卡氏菌

奴卡氏菌可以是重要的呼吸道致病菌。作培养的标本要立即送往实验室；但是短暂耽误时可放在4℃保存。标本直接涂片Gram染色镜下为精细、念珠状、Gram阳性菌、有分支、丝状或球杆状。奴卡氏菌具有部分抗酸性。培养奴卡氏菌没有特别的培养基；可生长在HBI沙保氏葡萄糖琼脂、羊血琼脂、或胰-豆胨琼脂。奴卡氏菌也可在分支杆菌的去污染处理中存活下来并在分支杆菌培养基中生长。对于污染严重的标本，如痰，推荐使用选择性BCYE琼脂（缓冲-活性炭-酵母粉琼脂）。培养于25—37℃，最好37℃，3周时间。 分支杆菌

要分离培养被污染的呼吸道标本中的分支杆菌，首先必须对标本进行去污染及浓缩处理。具体的一般使用去污染方法请参见相关内容。将标本离心涂片作一份抗酸染色找AFB。商品化的核酸扩增法可用于检测涂片AFB阳性的标本中的结核分支杆菌复合物。作培养时标本至少要接种于一份液体和固体培养基，培养至少6周，35℃，8% 的CO2环境。 3楼

yeec 发表于：2006-1-26 10:42:00 上呼吸道标本 鼻咽部

鼻咽部抽吸物、灌洗液、及拭子标本有助于诊断百日咳、白喉和衣原体感染，以及识别出脑膜炎奈瑟氏菌或金葡菌的携带者。鼻咽部标本培养不用于中耳炎的诊断。但是从儿童鼻咽部分离肺炎链球菌，监测其耐药性具有流行病学价值。 博德特氏菌属

首选标本为鼻咽细胞，用含有藻酸钙或涤纶纤维的小头拭子采集标本。人造丝或棉拭子不能用，因为其所含的脂肪酸对菌体有毒害。最好是床旁接种，如果不行，拭子标本应放于特殊的运送培养基中送到实验室。如果在2小时内送到，可用1%的水解酪蛋白氨基酸作为保护剂。如果24小时内不能接种的就要用含活性炭的Ami培养基。如果运送时间超过了24小时，例如标本需要送到参考实验室作培养，标本就应该保存在R-L运送培养基中送检。 直接检验标本中的博得特氏菌用的是DFA法。用于检测抗体的方法有可能不能区分百日咳菌和副百日咳菌。通常情况下，DFA试验用于检测百日咳的敏感性和特异性都相当低，只能作为一种补充试验，不能代替培养。

用于培养百日咳博得特氏菌的培养基是R-L活性炭琼脂，含有10%的马血和头孢。因为只有很少的百日咳百日咳博得特氏菌株会被头孢所抑制。还是建议使用不含头孢的R-L培养基。此外，将标本接种于含有1/3琼脂的培养基表面；当此琼脂送到实验室后再将其进一步分离划线接种。培养条件：35℃湿润环境，5到7天，不需要CO2。

PCR可能是检测百日咳博得特氏菌最敏感的试验方法。首选涤纶拭子采集标本，因为棉和藻酸盐对PCR反应有干扰。关于百日咳博得特氏菌检验的标本的采集、运送和处理请参见有关内容。

白喉棒状杆菌

作白喉棒状杆菌培养，最好同时送检鼻咽拭子和咽拭子。如果采集标本后立即送检，对运送培养基和运送条件就没有特殊的要求。如果要将标本送到参考实验室去，建议将其放在不含干燥剂的干燥容器中使其保持干燥；也可以将标本放入Ami 或Stuart?s运送培养基，或者接种于Loeffler?血清或亚碲酸盐琼脂培养基上并在35℃、5%CO2环境预培养过夜。标本涂片诊断白喉，作Gram染色并检查多形性的Gram阳性杆菌，一端或两端膨大及有略带紫红色的异染颗粒。其它的染色法所见菌体形态与Gram染色的一致，但是不能区分白喉棒状杆菌和其它棒状杆菌。标本应该接种于Loeffler?s血清琼脂平板或含有亚碲酸钾的培养基分离培养白喉棒状杆菌。培养条件：35℃，5%CO2，2天。 肺炎衣原体

诊断肺炎衣原体经常是作血清学试验；当要求作培养时，鼻咽拭子标本最好。培养操作已经在前面的下呼吸道标本中作了描述。 金黄色葡萄球菌

鉴别金葡菌携带者是用聚酯纤维的拭子在前鼻孔处采集鼻分泌物，将其放入试管运送系统并立即送往实验室。将标本接种于含5%的羊血琼脂平板、一种Gram阳性菌的选择性培养基、或甘露醇盐琼脂，一种用于选择葡萄球菌并有助于区分凝固酶阳性与凝固酶阴性的葡萄球菌的培养基。培养于35℃，2天。 脑膜炎奈瑟氏菌

鉴别脑膜炎奈瑟氏菌的携带者时，采用鼻咽拭子标本并用Ami或Stuar?s运送培养基送到实验室；另外还可以将标本直接接种在平板培养基上并放入含有CO2的容器中送检。不用作Gram染色，因为脑膜炎奈瑟氏菌在形态上不能与其它的上呼吸道的普通奈瑟氏菌区别开。标本应该接种在营养丰富的培养基上，如血琼脂或巧克力琼脂；改良的TM，M-L，或纽约培养基也可以用。培养条件：35℃，5%CO2，72小时。 咽喉部

咽拭子标本通常大多数都用于诊断A群链球菌咽炎。送检到检验科用于作常规细菌培养的咽拭子标本只能从这点上评估和考虑。咽拭子标本应该插入含有改良Stuart?s培养基的试管中立即送检，如果不能及时送检就应暂时短时冷藏。

有许多用于快速检测A群链球菌的商品试剂，有EIA、发光免疫法、及以核酸为基础的试验。据报道，EIA的敏感率在60%到95%不等，但是也有低到了30%的。发光免疫分析法其敏感率也不同，但是有些报道其敏感率较EIA好些。总之，核酸基础试验 的敏感率＞90%。所有直接法的特异性一般都很高，在95到100%。当要作快速直接试验时，应该采集2份咽拭子。如果结果阳性，则废弃余下的拭子；如果结果阴性，另一份拭子用于作培养，因为直接试验的敏感率＜100%。培养A群链球菌，既可以用血琼脂也可以用选择性血琼脂。使用选择性血琼脂便于观察但是会延缓细菌的生长。应该培养35℃，48小时，培养于通过厌氧培养降低氧张力的环境，或培养于5—10% CO2环境，或者在空气环境中用盖玻片将最初培养物盖上。这些培养条件也可培养C群和G群链球菌，这些菌可引起咽炎但是不会引起A群链球菌后遗症。

特殊考虑的问题 会厌炎

咽拭子标本有助于确诊会厌炎的病原体，病程进展快的蜂窝组织炎有可能引起气道阻塞（几乎总是由流感嗜血杆菌b型引起，偶尔也由金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌引起）。如果有必要，应该立即在病人插管处采集标本且只能由医生来操作。标本应接种于营养丰富的平板培养基，培养于35℃含有5—10% CO2环境，72小时。另外，会厌炎病原体的确认还可以通过血培养。 白喉

咽喉标本的培养对于诊断白喉十分重要。对标本的直接评估以及培养应参照前面鼻咽部标本部分所描述的进行操作。 溶血隐秘杆菌

溶血隐秘杆菌可引起咽炎和扁桃体周脓肿。此菌的培养可用培养A群链球菌的选择培养基。最好培养72小时。 淋病奈瑟氏菌

检验咽喉部的淋病奈瑟氏菌时，拭子标本应床旁接种或立即送检并尽可能接种于选择性培养基，例如TM培养基。培养于35℃，含有5—10% CO2环境，72小时。 其它标本

奋森氏咽峡炎是一种急性坏死性溃疡扁桃体炎,可以由梭杆菌属, 奋森疏螺旋体及其它厌氧菌引起。这种情况通常出现在口腔卫生不好的成年人及患有严重的系统性疾病的病人。实验室将从溃疡创面采集的拭子涂片作稀释石炭酸复红或Gram染色。镜下可见许多螺旋体，梭状杆菌，以及多核粒细胞就可初步诊断为奋森氏咽峡炎。对此作培养时不考虑需氧菌的培养，因为在口腔中有许多种厌氧菌；应该考虑作血培养，因为此疾病往往伴随有败血症。 组织标本

外科手术中采集的组织标本，考虑到其获得的成本费用很高而且还有病人所冒的危险。因此，要作出最佳的评估，就要采集足够的标本用以作组织病理学检验，同时也要作微生物学检验。组织病理学检验用以鉴别是感染还是肿瘤，而且也区分是急性的还是慢性的。对于慢性损害要鉴别诊断，所涉及的病原体有放线菌、布鲁氏菌、分支杆菌、及真菌；其中任何一种病原体的数量可能会很少。要强调的是采集标本是一定要有足够的量以供检查和培养。拭子很难满足量的需求，所以不予考虑。

采集到标本后，组织标本应该放入一无菌容器中并迅速送往实验室，防止标本干燥。一旦收到标本应将标本放入少量的无菌介质或无菌盐水中并均质化。用无菌的解剖刀将组织绞碎，用研钵和研棒或组织碾磨机或者用stomacher将其碾磨。碾磨好的标本用于涂片作Gram染色或其它染色（其特点如临床照片所示）并接种培养基。Gram染色应检查是否有微生物、粒细胞、及磷状上皮细胞（提示表面污染）。对于常规培养组织标本应接种于液体培养基和营养丰富的琼脂培养基以检出苛养菌。培养于35℃含有5到10% CO2环境。