农杆菌介导的植物转基因技术
一、实验目的
1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。
2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理； 掌握农杆菌介导转化植 物的实验方
法，了解转基因技术的操作流程。
二、实验原理
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化 性地感染大多数双子叶植物的受伤部位， 并诱导产生冠瘿瘤。 农杆菌通过侵染植 物伤口进入细胞后，可将
T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然 的植物遗传转化体系。人们将目的基因插
入到经过改造的 T-DNA区，借助农杆菌 的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术， 再生出转基因植株。
实验一 培养基配制
一、仪器和试剂
1、 仪器：高压灭菌锅，超净工作台
2、 药品： Beef extract （ 牛肉浸膏 ） 5g/L ， Yeast extract （酵母提取物 ） 1g/L ， Peptone （ 蛋白胨） 5g/L ， Sucrose （ 蔗糖） 5g/L ， MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ， Agar （琼脂）1.5g/100ml，MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙
酸），6-BA
（6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif ），链霉素（str ）。
二、实验方法
第一组配制YEB固体培养基
1、配制250mlYEB固体培养基：先称取 1.25g Beef extract （
牛肉浸膏）；
1.25g Peptone （蛋白胨）；0.25g Yeast extract （酵母提取物）；1.25g Sucrose
（蔗糖）;1g MgS04.7H2O琼脂粉3.75g ;将上述药品置于250ml三角瓶中，用 量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=7.4。
2、 灭菌：将盛有 250ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名 称，用高压
灭菌锅进行灭菌。
3、 抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到 50-60 C时（手可触摸） 加入已经
过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ）,以免温度过 高导致抗生素失效。
4 、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒 15ml 培养基，可以倒 16个 平皿，倒完后
打开平皿盖，在紫外灯下照10min,等待培养基凝固，盖上平皿盖， 封口备用。
第二组配制YEB液体培养基
1、 配制500mlYEB液体培养基：先称取2.5g Beef extract （牛肉浸膏）;2.5g Peptone （蛋白胨）; 0.5g Yeast extract （酵母提取物）; 2.5g Sucrose （蔗糖）; 2g MgSO4.7H2O将上述药品置于500ml三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将 其溶解混匀，然
后再定容至 500ml，用NaOH调pH=7.4。
2、 灭菌：将盛有 500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名 称，用高压
灭菌锅进行灭菌。
3、 抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到 50-60 C时（手可触摸） 加入已经
过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ），以免温度过 高导致抗生素失效。
4 、分装：将培养基分别分装到试管和三角瓶中，每个试管中分装
装12个试管。每个三角瓶中倒入35ml，共12个三角瓶。
5ml，分
5、分装好后，封口备用。
第三组配制MS液体培养基
1、配制500mlMS液体培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称 取2.15gMS
粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入 5ml 100倍Fe盐浓缩液； 5ml100倍肌醇浓缩液；
5ml有机溶液的混合液，然后混匀定容至500ml,用NaOH 调 pH=5.8。
2、 灭菌：将盛有 500ml 培养基的三角瓶封口， 在三角瓶表面写清培养基名称， 用高压
灭菌锅进行灭菌。
3、 乙酰丁香酮的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到
摸）加入已经过滤好的乙酰丁香酮。
50-60 C时（手可触
4、分装：将培养基分别分装到三角瓶中，每个三角瓶中倒入 40ml，共12个
5、分装好后，封口备用。
第四组配制MS共培养基
1、 配制500mlM9固体共培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称 取2.15gMS
粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入 5ml 100倍Fe盐浓缩液； 5ml100倍肌醇浓缩液；
5ml有机溶液的混合液，然后加入激素 NAA和6-BA （按 照实际需要，根据母液浓度计算用
量），混匀定容至500ml，用NaOH调pH=5.8, 然后再加入 7%的琼脂粉 3.5g。
2、 灭菌：将盛有 500ml 培养基的三角瓶封口， 在三角瓶表面写清培养基名称， 用高压
灭菌锅进行灭菌。
3、 分装：将培养基分别分装到平皿中，每个平皿中倒入25ml，共20个平皿。 4、 分装好后，封口备用。
第五组配制MS分化筛选培养基
1、 配制1000mlM9固体共培养基：用2个500ml三角瓶进行盛取，先在500ml 三角瓶中
加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其 中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液， 然后加入激素NAA和6-BA （按照实际需要，根据母液浓度计算用量），混匀定容 至500ml，用NaOH调pH=5.8，然后再加入7%勺琼脂粉3.5g。
2、 灭菌：将盛有 500ml 培养基的三角瓶封口， 在三角瓶表面写清培养基名称， 用高压
灭菌锅进行灭菌
3、 分装：将培养基分别分装到平皿中，每个平皿中倒入25ml,共40个平皿。 4、 分装好后，封口备用。
第六组配制MS生根培养基
1、 配制500mlM9固体共培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称 取
2.15gMS粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入 5ml 100倍Fe盐浓缩液； 5ml100倍肌醇
浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后加入激素 NAA和6-BA（根 据母液浓度计算用量），混匀定容至500ml，用NaOH调pH=5.8，然后再加入7% 的琼脂粉3.5g。
2、 灭菌：将盛有500ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称， 用高压灭菌
锅进行灭菌。
3、 分装：将培养基分别分装到100ml三角瓶中，每个三角瓶中倒入35ml， 共14个三角
瓶。
4、 分装好后，封口备用。
实验二植物转化工程菌的制备
一、仪器和试剂
1仪器：低温离心机（德国EPPENDO公司）；恒温培养箱（哈东联）；超净工作 台（苏州净
化），恒温摇床。
2 试剂：根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens.）菌种 EHA105 YEB培养基， 接种
环，牙签。
二、实验方法
1、 将农杆菌接种于附加50mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素、50mg/L利福
平的YEB固体培养基上，28E暗培养48h，至长出单菌落。
2、 用接菌环挑取单菌落，接种在含相应抗生素的YEB液体培养基中，于28C, 180rpm,
培养过夜。
3、 待菌液长至OD600为0.4 ~ 0.6 时，将其按1 : 10的比例接种到新鲜的 上述培养
基中振荡培养，进行二次活化。
实验三农杆菌侵染转化
一、仪器和试剂
1仪器：超净工作台（苏州净化），植物组织培养箱 2试剂：根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens.）菌种EHA105红花无菌苗,
MS液体培养基，共培养基（MS+6-BA+NAA手术刀，镊子，剪刀，滤
纸，培养皿。
二、实验方法
1、 当农杆菌OD60C为0.5 ~ 0.6时，吸取菌液于无菌50ml离心管中，2000 rpm,离心10mi n,弃上清，收集菌体，用等体积的 MS液体培养基将菌体重悬， 备用。
2、 侵染 取红花无菌苗，在超净工作台中将子叶上下边缘切掉，置于无菌
培养皿内，加入适量重悬好的菌液，侵染 8~25 min （第一组侵染8min，第二组 侵染10min，第三组侵染12min，第四组侵染15min，第五组侵染20min，第六组 侵染25min）,此间要不时的摇动。
3、 除菌 侵染完成后，弃去菌液，用无菌滤纸吸干多余的菌液。
4、 共培养 侵染过的红花子叶接种于共培养培养基上，28E暗培养3d，观 察是否有农杆
菌过量生长。
实验四农杆菌侵染转化
一、 仪器和试剂
1仪器：超净工作台（苏州净化），植物组织培养箱。
2试剂：根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens.）菌种EHA105红花无菌苗,
无菌水，分化培 养基 （MS+6-BA,滤纸，镊子，培养皿。
二、 实验方法
1、 除菌 取共培养后染菌的植物材料，放于无菌三角瓶内，先用无菌水（可 以添加抗生
素）冲洗至溶液澄清为止。（如果没有农杆菌滋生的，此步骤可省略）
2、 分化培养 将除菌后的植物材料转至分化筛选培养基中进行转化筛选， 诱导再生植
株，每天观察，记录分化情况，以后每两周继代一次。
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