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LC480 Software1.5中文说明书维护SOP-2010-4-10

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面中选定要设置的亚组名,在右边反应板孔位处选定该亚组所包含的孔位,使所选定的孔位中都出现深兰色凹陷的

,点击下方

按钮加以确认。

设置亚组可以在一块反应板上实现多个检测项目的实验,前提是这些检测项目的实验运行程序都一致(这在使用TaqMan水解探针时比较容易实现),由于各检测项目均有各自的质控对照,因而,设定亚组可以单独对各检测项目进行分析。

2.样本属性编辑

点击New Experiment界面左侧按钮设置样本信息。在“Workflow”一栏在选择实验方案:

Abs Quant:绝对定量或定性分析;Rel Quant:相对定量;Scanning:基因扫描; Color Comp:颜色补偿;Tm:熔解温度检测;Melt Geno:熔解曲线法基因分型; Endpt Geno:终点法基因分型。

在Select Samples/Subset选项中选定待编辑的样本亚组:

在界面右方编辑各样本的名称属性等:

Pos:样本在96孔板或384孔板上的座标位置;Repl Of:重复样本设置;

Sample Name:样本名称;Quantification Sample Type:定量样本类型;Concentration:浓度;Target Name:检测类型。

在进行绝对定量检测实验时,参与实验的样本有标准品(一般4至5个)、阴性对照、阳性对照、未知样本。各样本的名称可参考以上“Sample Name”中的命名习惯(STD表示标准品、NC表示阴性对照、Positive表示阳性对照、Sample表示待检测的未知样本),也可以自行编辑。

在“Quantification Sample Type”一栏内需要对各样本的类型进行明确地编辑(标准品选Standard类型、阴性对照选Negative Control类型、阳性对照选Positive Control类型、未知样本选Unknown类型),此外标准品系已知浓度的阳性样本,其设定为

Standard类型后还需在Concentration一栏中对各标准品分别设定其相应的浓度,以及在Abs Quant/Units填写框中填写相应的浓度单位,如copies、pg等。

在Target Name一栏中可以填写该检测实验所要检测的指标,如乙肝病毒、禽流感病毒、沙门氏菌等。

如在实验中需要设置重复样本的,可在Repl Of一栏中填写该样本其所重复的样本的座标号(注意,只能填写座标号,不能填写样本名)。

如进行的是多色荧光PCR检测实验,则在Select Filter Combinations一栏中选定各检测通道,分别进行样本编辑。

在进行定性检测实验时,参与实验的样本有阴性对照、阳性对照、未知样本。设置相应较简单,可参考以下设置

六.运行实验

实验程序和样本均设置完毕后,即可运行实验,具体操作:进入“New

Experiment”界面,点击左侧按钮,如反应板已经放入仪器,仪器主机正面右侧的LED灯会由桔黄色变为绿色,软件界面右下边的这时点击“Start Run”按钮,软件界面跳出一对话框提示用户给该实验文件命名,以保存实验结果。一般建设用户以时间命名,以方便日后查找实验结果,如20080816-HBV-1,20080817-AIV-2等。命名后点击确认键,仪器就开始运行了,在运行过程中可观察到温度和荧光信号的变化曲线。如进行多重荧光PCR实验,可在荧光历史“Fluorescence History”界面内上的下拉菜单中切换不同的检测通道,以分别观察其扩增情况。

在实验运行过程中,用户可以根据需要,点击“+10 Cycles”按钮增加正在运行的程序10个循环,也可以点击“End Program”按钮终止正在运行的子程序,直接进入下一个子程序。

七.数据分析(定性和定量)

实验运行完毕后,点击界面左侧的

按钮分析数据。或者打开LightCycler480

软件,成功登录后点击右侧图标,进入Navigator导航界面,在目录树内选定之前已完成的实验文件,点击下方“Open”按钮,或双击文件名打开实验文件,点击左侧按钮,进入分析界面。

在“Create new analysis”窗口内显示了可使用的分析方法,在“Open existing analysis”窗口内显示已经进行分析的结果内容。

要进行定性和定量分析可以选择Abs Quant分析功能,其有两种分析模式,2nd Derivative Max二阶最大求导法和Fit Points点拟合法。选定分析功能类型后会跳出对话框,用户可以自行选择分析类型、选择要分析的亚组(Subset),以及命名分析结果(Name)。点击“√”按钮确认。

在Analysis界面中选择Abs Quant/2nd Derivative Max,点击“Calculate”按钮,生成Cp值,如实验中有标准品,则同时生成标准曲线,并且计算出各未知样本的浓度值。该方法在反应体系优化得比较成熟,信号噪音比较低时使用较好。

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