五、实验案例 案例一 以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取 课前准备
本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。
教师可以到市场售活鸡处索取鸡血，所带烧杯中必须提前放入抗凝剂柠檬酸钠溶液。具体制备方法如下。取质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液100 mL，置于500 mL烧杯中，注入新鲜的鸡血（约180 mL），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免血液凝结。将烧杯中的血液置于冰箱内，静置1 d，使血细胞自行沉淀。有条件的学校也可以将血液倒入离心管内进行离心，用2 000 r/min或3 000 r/min的转速，离心2 min，使血细胞沉淀于离心管底部，这样可以使血细胞沉淀更完全。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。值得注意的是鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。
提取DNA的具体步骤： 1.破碎细胞，释放DNA
鸡血细胞中的DNA与核蛋白结合，位于鸡血细胞的细胞核中，正常情况下是不会释放出来的。为了使DNA从细胞核中释放出来，需要向鸡血细胞液中加入蒸馏水，并且搅拌，从而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加速细胞的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。一般5～10 mL的鸡血细胞液加入20 mL蒸馏水搅拌5 min。释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用3～4层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。
2．溶解细胞核内的DNA：在浓度较高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游离出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入两倍体积的浓度为2 mol/L的NaCl溶液，搅拌1 min。注意应沿一个方向搅拌，使DNA充分溶解。
3．DNA的析出
将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。教材中列举了提取DNA的三种方案，本案例选取方案一。加蒸馏水降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的终浓度为0.1～0.2 mol/L。加水过程一般分三次进行，当总加水量为300 mL左右时，DNA已基本析出。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。
用3～4层纱布对DNA稀释液进行过滤，滤去蛋白质，收集DNA的黏稠物。如果采用离心法，效果更好。用4 000 r/min转速的离心机，离心15 min，除去上清液(含有蛋白质)，留下的沉淀物中含有DNA。此时注意观察DNA黏稠物的颜色。
4.DNA的初步纯化
如果提取的DNA量不够多且其中含有较多杂质，或者加入溶液和搅拌等操作过程不规范，都会导致实验现象不明显，常常使制取的DNA粗制品不能显示出DNA的本色──白色。为了增进实验效果，需要对DNA粗制品进行简单的提纯，下面的方案可供参考。
将DNA黏稠物再溶解，继续用2 mol/L的NaCl溶液20 mL溶解DNA黏稠物，仍旧沿一个方向不停搅拌3 min，使DNA充分溶解，以免损失。用3～4层纱布进行过滤（或离心），
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滤去杂质，收集含有DNA的滤液。向滤液中贴壁缓慢加入50 mL预冷的体积分数为95％的乙醇，并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌，溶液中会出现DNA丝状物。
实验一般要求采用预冷的95％的乙醇，但对比结果显示，常温下的乙醇溶液也可产生明显效果。从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。此时悬浮于溶液中的DNA丝状物相对含杂质较少，如果出现的丝状物较少，可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分钟。浓缩后的DNA丝状物，可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起(因为玻璃棒有吸附DNA的作用)。如果DNA丝状物较少，不易吸附在玻璃棒上，也可以用筷子等表面粗糙的用具来帮助DNA分子缠绕。
DNA的纯化还有许多其他方法。例如，添加质量分数为25％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，使蛋白质变性后与DNA分开。随后，加入氯仿—异丙醇混合液（体积比为24∶1），通过离心将蛋白质及其他杂质除去,取上清液。可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性。利用苯酚处理后，离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白质变性存在于酚层中，这时可用分液漏斗或吸管等仪器将二者分开。教师可以根据学校的条件让学生自己设计实验方案，比较实验结果。
5．DNA的鉴定
二苯胺法二苯胺试剂的配制及鉴定DNA的方法参见教科书。需要注意的是，二苯胺试剂在冰箱内可保存6个月，使用前需摇匀。
紫外灯照射法用蒸馏水配制质量分数为0.05%的溴化乙锭(EB)溶液，将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹到蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中)，可呈现橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在260 nm处)。
电泳法此方法适合鉴定纯度较高的DNA。有条件的学校可以参考本专题课题2的实验案例和参考资料部分。
案例二 以菜花为实验材料进行DNA的粗提取
课前准备 将新鲜菜花和体积分数为95％的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24 h。 提取DNA的具体步骤：
1.取材 称取30 g菜花，去梗取花，切碎。
2.研磨 将碎菜花放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min。
研磨液的配制方法如下。将10.1 g Tris加入到50 mL蒸馏水中，使其溶解，然后，用2 moL/L的HCl溶液调节pH至8.0，再加入8.76 g NaCl 、37.2 g EDTA 、20 g SDS。待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至1 000 mL。
教材中建议采用洗发香波、洗涤剂等一些去污剂，使植物细胞膜破碎，释放DNA。学生可以设置对照实验，比较哪一种方法可以提取到纯度更高的DNA。一般实验室提取高纯度的DNA都采用一种阳离子去污剂──十六烷三甲基溴化铵分离缓冲液，使细胞膜破碎，同时将DNA与植物中多糖等杂质分开，再用氯仿—异丙醇混合液（体积比为24∶1）抽提去除杂质蛋白，得到高纯度的DNA。
3.过滤 在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000 r/min的转速，离心2～5 min，取上清液放入烧杯中)。在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
4.沉淀 将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95％的预冷乙醇溶液中，并用
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玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部)。沉淀3～5 min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上。
六、课题成果评价
（一）是否提取出了DNA
观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。
（二）分析DNA中的杂质
本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。 （三）不同实验方法的比较 对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
七、答案和提示 （一）旁栏思考题
1．为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。
2．加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
3．如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
4．此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。 5．为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
6．方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
（二）练习
1．答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。
2．答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。
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八、参考资料
1.二苯胺鉴定DNA的化学原理
DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。
2.研磨液中几种药品的作用
Tris/HCl:提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态（Tris为三羟甲基氨基甲烷）。 EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。 SDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与DNA分离。
课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段
一、课题目标
本课题通过尝试PCR（DNA多聚酶链式反应）技术的基本操作，使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法，理解PCR的原理，讨论PCR的应用。
二、课题重点与难点
课题重点：PCR的原理和PCR的基本操作。课题难点：PCR的原理。 三、课题背景分析
课题背景首先介绍了PCR是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术，然后说明这一技术在遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆等方面都有着广泛的应用，最后指出本课题的目标是了解PCR技术的基本原理，并尝试用PCR技术扩增DNA片段。
四、基础知识分析
（一）PCR原理：知识要点：1.细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件；
2.DNA的合成方向；3.Taq DNA聚合酶的应用。
（二）PCR的反应过程：知识要点：PCR的基本步骤及每个步骤所发生的变化。 五、实验案例
PCR扩增双歧杆菌编码16SrRNA的DNA片段
1.双歧杆菌的培养。本实验用双歧杆菌作为实验材料，需要在实验前一天培养双歧杆菌。双歧杆菌的培养基配方如下。
大豆蛋白胨5.0 g 胰胨5.0 g 酵母提取物10 g
葡萄糖10 g 微量盐溶液40 mL 半胱氨酸盐酸盐0.5 g 0.1%（0.1 g/100 mL）刃天青 1 mL
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH至7.0。 其中，微量盐溶液的配方如下。 CaCl2 0.2 g MgSO4·7H2O 0.48 g K2HPO4 1 g KH2PO4 1 g NaHCO3 10 g NaCl 2 g 培养双歧杆菌24 h后，将菌液进行离心，双歧杆菌将沉淀在试管底部。
2．PCR操作。往双歧杆菌的沉淀中加入0.2 mL裂解液（裂解液配方为50 mmol/ L 的Tris-HCl , 0.5 %的Tween 20, 1 mg/ mL的蛋白酶K，pH为8.0），使细胞裂解，释放出DNA。将裂解液在55 ℃温度下加热孵育3 h后，再在95 ℃温度下加热10 min，然后立即放入冰水中冷却。冷却后离心，将10 μL上清液转移到0.5 mL的离心管中，然后依次加入10倍浓缩的扩增缓冲液5 μL、25 mmol/ L 的MgCl2溶液3 μL，20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL(2U/μL)，蒸馏水29 μL，两种引物(25 μmol/ L) 各0.5 μL。
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