四国药典细菌内毒素对比

低点的检测值或反应时间大于标准曲线最低点的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r ) 的绝对值应大于或等于0.980，试验方为有效。否则须重新试验。 干扰试验选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度(设为λm)，作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。 按表4 制备溶液A、B、C和D。 表4 光度测定法干扰试验溶液的制备 编号 A B C D 内毒素浓度 无 标准曲线的中点（或附近点）的浓度（设为λm）至少3个浓度（最低一点设为λ）无 被加入内毒素的溶液 供试品溶液供试品溶液检查用水 检查用水 平行管数 至少2 至少2 每一浓度至少2 至少2 注：A 为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。 B 为加人了标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的，且与溶液A 有相同稀释倍数的供试品溶液。 C 为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。 D 为阴性对照。 按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量ct和cs，再按下式计算该试验条件下的回收率(R）。 R= (cs-ct)/ λm×100% 当内毒素的回收率在50%-200%，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。 当内毒素的回收率不在指定的范围内，须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素，并重复干扰试验来验证处理的有效性。 当鲎试剂、供试品的来源、处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。 检査法 按“光度测定法的干扰试验” 中的操作步骤进行检测。 使用系列溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。 试验必须符合以下三个条件方为有效：(1)系列溶液C的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求； (2)用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率要在50%-200%的范围内； (3) 阴性对照的检测值小于标准曲线最低点的检测值或反应时间大于标准曲线最低点的反应时间。 结果判断 若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判定供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，判定供试品不符合规定。 注：本检査法中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。 EP(8.0) （1） 浊度法 本法利用检测鲎试液凝胶的浊度变化来测定供试品中内毒素的浓度。根据检测原理，这种方法又可分为终点浊度法和动态浊度法。 终点浊度法（方法F）系依据在孵育终止时，反应混合物的浊度（吸光度或透光率）与内毒素浓度之间的量化关系来测定内毒素含量的方法。 动态浊度法（方法C）是检测反应混合物的浊度达到某一预先设定的浊度到达某一预先设定的吸光度需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。 根据鲎试剂生产商的建议，光度测定试验应在孵育温度下进行（通常为37±1℃）。 （2） 显色法（方法D和E） 该法系利用检测鲎试剂与内毒素反应使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素的含量的方法。根据检测原理，这种方法又可分为终点显色法和动态显色法。 终点显色法（方法E）是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。 动态显色法（方法D）是检测反应混合物的色度达到某一预定吸光度（或透光率）所需要的反应时间，或检测色度增长速度的方法。 根据鲎试剂生产商的建议，光度测定试验应在孵育温度下进行（通常为37±1℃）。 （3） 预备试验 为确保浊度法和显色法试验结果精确、有效，应根据下面的说明，预先进行标准曲线的可靠性和干扰因素试验。 当实验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需要验证试验方法。 （i） 标准曲线的可靠性试验 用内毒素标准溶液制成至少三个浓度的稀释液，以获取标准曲线。按照鲎试剂生产商的建议（体积比、孵育时间、温度、pH等），每一内毒素标准浓度的溶液至少做三支平行管。 使用动态法检测时，如预期范围超过2 log，为使标准曲线反映出每个对数增长，应相应增加标准品溶液。 在鲎试剂生产商规定的内毒素浓度范围内，相关系数的绝对值︱r︱必须大于等于0.980。 （ii） 干扰因素试验 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度。 按表2.6.14-4制备溶液A、B、C、D。在鲎试剂生产商的建议测试条件（供试品和鲎试液体积、供试品于鲎试液的体积比、孵育时间等）下，对这些溶液开展试验，每种溶液至少做两组平行。 表2.6.14-4 溶液 A B C D 内毒素浓度 无 标准曲线的中点0 配制内毒素的溶液 供试品溶液供试品溶液 平行管或微孔数 不少于2个 不少于2个 每一浓度不少于2个 不少于2个 至少3个浓度（最低浓度规定为λ）BET检查用水 BET检查用水 溶液A=稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。 溶液B=加入了标准曲线终点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的、且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。 溶液C=如“3.预备实验（i）标准曲线的可靠性试验”项下描述的、用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。 溶液D=BET检查用水（阴性对照） 用含标准内毒素的供试品溶液的平均内毒素含量减去供试品溶液的平均内毒素含量，计算内毒素的平均回收率。 当内毒素的回收率在50%-200%之间时，可认为在此试验条件下供试品溶液中不存在干扰因素。 当内毒素的回收率不在指定范围内，应根据凝胶法章节的“1.预备实验（ii）干扰因素实验”项下的说明排除干扰因素。重复干扰因素实验以验证处理的有效性。 （2） 检查法 （i） 方法 按 “（3）预备试验下的（ii）干扰因素试验”项下操作步骤。 （ii） 计算 用系列溶液C生成的标准曲线计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。 试验必须符合以下三个条件方有效。 a. 溶液D（阴性对照）的试验结果不得大于所用鲎试剂的说明书中规定的空白值的限度。 b. 阳性对照系列溶液C的检查结果要符合“3.预备实验（i）标准曲线的可靠性试验”中的要求。 c. 用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的回收率在50%-200%的范围内。 （iii） 结果判断 若校正了稀释倍数和浓度后，由溶液A的内毒素浓度计算得到的供试品内毒素平均浓度小于供试品的内毒素限度，可判断供试品符合细菌内毒素检查的要求。 （3） 试剂 （i） 鲎试液 根据鲎试剂生产商的建议，用BET检查用水或缓冲液溶解鲎试剂，轻轻搅拌。根据鲎试剂生产商的建议，在冷冻或冰冻条件下贮存鲎试液。 （ii） 鲎试剂 鲎试剂系从鲎（美洲鲎或中华鲎）的阿米巴细胞溶解产物制备而来。该试剂仅指在符合有关权威法规的生产条件下生产的鲎试剂产品。 鲎试剂除了能与内毒素发生反应外，也能与某些β-葡聚糖反应。制备不与β-葡聚糖反应的鲎试剂时，需用鲎变形细胞溶解物中除去可与β-葡聚糖反应的G因子，或抑制G因子反应系统，这样制备得到的鲎试剂可在葡聚糖存在的情况下检测内毒素。 （iii） BET检查用水（细菌内毒素检查用水） BET检查用水指注射用水R或由其他方法制取的内毒素含量低于所用鲎试剂的检测限的水。 为提供相关信息，有下面的章节。 USP(36) 浊度法系测量浊度的增加。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度及其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在的定量关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。 显色法系利用检测LAL试剂与内毒素反应使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素的含量的方法。这种方法也可分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的定量关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预定吸光度（或透光率）所需要的反应时间，或检测色度增长速度的方法。 根据LAL试剂生产厂家的建议，光度测定试验的试验温度一般为37±1℃。 光度测定法的预备试验 为确保浊度法和显色法试验结果精确、有效，应根据下面的说明，预先进行标准曲线的可靠性和干扰因素试验。如试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，必须重新进行验证。 标准曲线的可靠性试验——用内毒素标准溶液，制成至少三个浓度的稀释液，以获取标准曲线。根据LAL试剂生产厂家的说明（体积比、孵育时间、温度、pH等），每种标准内毒素浓度至少做三支平行管。如动态法的预期范围超过2个对数，为使标准曲线反映出每个对数增长），应相应增加标准品溶液。根据LAL试剂生产厂家的要求，相关系数的绝对值︱r︱必须大于等于0.980。 干扰因素试验——选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度。按表4制备溶液A、B、C、D，每种溶液至少做两组平行。遵照LAL试剂生产厂家的说明（供试品和LAL试剂体积、供试品与LAL试剂的体积比、孵育时间等），对这些溶液开展试验。