表4 光度测定法干扰试验溶液的制备 溶液 A B C D 内毒素浓度 无 标准曲线的中点无 配制内毒素的溶液 供试品溶液供试品溶液 平行管或微孔数 不少于2个 不少于2个 每一浓度不少于2个 不少于2个 至少3个浓度（最低一点设为λ）LAL试剂用水 LAL试剂用水 溶液A：稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。 溶液B：加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的、且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。 溶液C：为“光度测定法的标准曲线可靠性试验”项下描述的、用于制备标准曲线的内毒素溶液（阳性对照系列）。 溶液D：LAL试剂用水（阴性对照）。 用含标准内毒素的供试品溶液的平均内毒素含量减去供试品溶液的平均内毒素含量，计算内毒素的平均回收率。当内毒素的回收率在50%-200%之间时，可认为在此试验条件下供试品溶液中不存在干扰因素。 当内毒素的回收率不在指定范围内，应根据“凝胶法预备实验的干扰因素实验”项下的说明排除干扰因素。重复干扰因素实验以验证处理的有效性。 光度测定法的操作步骤 按“凝胶法预备实验的干扰因素实验”项操作。 光度测定法的结果计算 用C系列阳性对照品得到的标准曲线，计算溶液A的所有平行管的内毒素含量。只有在符合下列两种情况时，试验方有效。（1）对照品系列溶液C的结果符合“光度测定法预备实验的标准曲线可靠性试验”的要求；（2）用溶液B中的内毒素浓度减去溶液中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率应在50%-200%的范围内；（3）阴性对照品系列溶液D的试验结果不超过LAL试剂说明书中关于空白值限度的要求。 光度测定法的结果判断 使用光度测定法时，若校准了稀释度和浓度之后，溶液A的所有平行管的平均内毒素浓度小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。 JP(16) （1） 浊度法 本法利用检测鲎试液凝胶的浊度变化来测定供试品中内毒素的浓度。这种方法又可分为终点浊度法和动态浊度法。 终点浊度法系依据在指定的反应时间内，反应混合物的浊度与内毒素浓度之间的量化关系来测定内毒素含量的方法。 动态浊度法是检测反应混合物的浊度达到某一预先设定的浊度（或检测浊度增加速度）与内毒素浓度之间的量化关系来测定内毒素的含量的方法。 光度测定试验的温度通常为37±1℃；浊度亦可用吸光度表示。 （2） 显色法 该法系利用检测鲎试剂与内毒素反应使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素的含量的方法。这种方法又可分为终点显色法和动态显色法。 终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预定吸光度（或透光率）所需要的反应时间，或检测色度增长速度的方法。 显色试验的温度通常为37±1℃。 （3） 预备试验 为确保浊度法和显色法试验结果精确、有效，应根据下面的说明，预先进行标准曲线的可靠性和干扰因素试验。 （i）标准曲线的可靠性试验 每批鲎试剂都必须通过标准曲线的可靠性试验。用内毒素标准溶液，制成至少三个浓度的稀释液，以获取符合所用鲎试剂说明书上描述的内毒素浓度范围的标准曲线。在鲎试剂的最佳使用条件下（体积比、孵育时间、温度、pH等）开展试验，每一内毒素标准浓度至少做三支平行管。如预期范围超过2个对数，为使标准曲线反映出每个对数增长，应相应增加标准品溶液。 就设定的内毒素浓度范围而言，相关系数的绝对值︱r︱必须大于等于0.980。 如试验无效，确认试验条件之后，重新开展实验。 如试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，必须再次开展标准曲线的可靠性试验。 （iii） 干扰因素试验 按表4制备溶液A、B、C、D。在鲎试剂的最佳测试条件（供试品和鲎试液体积、供试品于鲎试液的体积比、孵育时间等）下，对这些溶液开展试验。 如发生了任何可能影响检验结果的条件变化，必须重新开展干扰因素试验。 表4 溶液 A 内毒素浓度 0 配制内毒素的溶液 供试品溶液*1 平行管或微孔数 不少于2个 B C D 标准曲线的中点*至少3个浓度*0 2 供试品溶液*1 不少于2个 每一浓度不少于2个 不少于2个 3 BET检查用水 BET检查用水 *1 供试品溶液的稀释倍数不得超过MVD。 *2 加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的供试品溶液。 *3 为“（3）预备试验下（i）标准曲线的可靠性试验”项下描述的标准内毒素溶液的浓度。 只有在符合下列两种情况时，试验方有效。 1． 溶液C得到的标准曲线的相关系数的绝对值大于或等于0.980。 2． 溶液D的试验结果不得大于所用鲎试剂的说明书中规定的空白值的限度，或必须小于所用鲎试剂的内毒素检测限。 用溶液B的内毒素含量减去溶液A中内毒素的含量，计算溶液B的内毒素的回收率。 当溶液B的内毒素的回收率在50%-200%之间时，可认为在此试验条件下供试品溶液中不存在干扰因素。 当内毒素的回收率不在指定范围内，则判定在此试验条件下供试品溶液中存在干扰因素。如果供试品不符合该试验的要求，应将供试品进一步稀释，但稀释倍数不得超过MVD，再重复进行试验。对供试品溶液或供试品的稀释液进行适当处理（如过滤、中和、透析、加热处理等）可排除干扰。 （2） 含量分析 （i） 方法 按表4制备溶液A、B、C、D，试验步骤同“（3）预备试验下的（ii）干扰因素试验”项下的说明。 （ii） 内毒素浓度的计算 用溶液C的标准曲线计算溶液A的内毒素浓度。试验必须符合以下三个条件方有效。 1. 溶液C的标准曲线的相关系数的绝对值大于或等于0.980。 2. 用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的回收率要在50%－200%的范围内。 3. 溶液D的试验结果不得大于所用鲎试剂的说明书中规定的空白值的限度，或必须小于所用鲎试剂的内毒素检测限。 （iii） 结果判断 若由溶液A的内毒素浓度计算得到的供试品内毒素含量符合具体专论中的内毒素限度（单位为EU/mL、EU/mg、EU/mEq、EU/unit）的要求，可判断供试品符合细菌内毒素检查的要求。
小结：
细菌内毒素检测法，CP、EP、USP、JP中所描述的检测方法一致，包括种类、操作基本相同。EP、USP、JP中有关于鲎试剂的介绍，CP中没有对这方面进行描述。检测方法EP、USP、JP比CP描述的更加详细，例如鲎试剂的反应原理、供试品溶液表示方法等。
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