___________橡胶树三倍体的2n配子来源及发生途径鉴定___________

南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2018，49（2）：208-213·208·南方农业学报ISSN2095-1191；CODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com49卷DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.02.02橡胶树三倍体的2n配子来源及发生途径鉴定

张源源，方家林，黄

海南儋州

肖，李维国，安泽伟

571737）

（中国热带农业科学院橡胶研究所/国家橡胶树育种中心/农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，

摘要：【目的】明确形成三倍体橡胶树云研77-2和云研77-4的2n配子来源及发生途径，为利用天然2n配子杂交选育多倍体新品种提供参考。【方法】以三倍体橡胶树云研77-2和云研77-4及其亲本为试验材料，通过SSR分子标记鉴定其2n配子来源及发生途径，并分析2n配子传递亲本的杂合性。【结果】分别通过4个位点可判定形成云研77-2和云研77-4的2n配子来源于母本GT1，无位点判定2n配子来源于父本PR107。从8个位点判定形成云研77-2的2n配子发生途径为第一次减数分裂核复原（FDR），从2个位点判定形成云研77-2的2n配子发生途径为第二次减数分裂核复原（SDR），形成云研77-2的2n配子发生途径为FDR的概率为80.00%。从8个位点判定形成云研77-4的2n配子发生途径为FDR，从3个位点判定形成云研77-4的2n配子发生途径为SDR，形成云研77-4的2n配子的发生途径为FDR的概率为72.73%。形成云研77-2和云研77-4的2n配子分别传递亲本60%和70%的杂合性。【结论】形成云研77-2和云研77-4的2n配子均来源于母本GT1，且其发生途径均为FDR。

关键词：橡胶树；三倍体；2n配子；发生途径；第一次减数分裂核复原（FDR）；第二次减数分裂核复原（SDR）

中图分类号：S794.104

文献标志码：A

文章编号：2095-1191（2018）02-0208-06

Sourcesandformationpathwayidentificationof2ngametesin

triploidrubbertrees

ZHANGYuan-yuan，FANGJia-lin，HUANGXiao，LIWei-guo，ANZe-wei

（RubberResearchInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/StateCentreforRubberBreeding/Key

LaboratoryofBiologyandGeneticResourcesofRubberTree，MinistryofAgriculture，Danzhou，Hainan571737，China）Abstract：【Objective】Thesourcesandformationpathwayof2ngameteswhichformedtriploidrubbertreesYunyan77-2andYunyan77-4werestudiedtoprovidereferenceforhybridizationbreedingofpolyploidnewvarietiesusingnatu-ral2ngametes.【Method】TriploidrubbertreesYunyan77-2，Yunyan77-4andtheirparentswereusedastestmaterials.Thesourcesandformationpathwayof2ngameteswereidentifiedbySSRmarkers，andheterozygosityoftransferparentsof2ngameteswereanalyzed.【Result】Sourcesof2ngameteswhichformedYunyan77-2andYunyan77-4derivedfromfemaleparentGT1wereidentifiedbyfourlocirespectively，whiletherewasnolocuswhichdeterminedthat2ngametesderivedfrommaleparentPR107.Eightlocideterminedthattheformationpathwayof2ngameteswhichformedYunyan77-2wasthefirstdivisionrestitution（FDR），twolocideterminedthattheformationpathwayof2ngameteswhichformedYunyan77-2wasseconddivisionrestitution（SDR）.Theprobabilityof2ngameteformingYunyan77-2throughFDRwas80.00%.Eightlocideterminedthattheformationpathwayof2ngameteswhichformedYunyan77-4wasFDR，threelocideterminedthattheformationpathwaywasSDR，theprobabilityof2ngameteformingYunyan77-4throughFDRwas72.73%.The2ngameteswhichformedYunyan77-2andYunyan77-4transferred60%and70%heterozygosityofthepa-rentsrespectively.【Conclusion】The2ngameteswhichformYunyan77-2andYunyan77-4alloriginatefromthefemaleparentGT1，andtheformationpathwayof2ngametesisFDR.

Keywords：rubbertree；triploid；2ngamete；formationpathway；firstdivisionrestitution（FDR）；seconddivisionrestitution（SDR）

0引言

【研究意义】三倍体可通过二倍体和四倍体杂

交或未减数配子（2n配子）杂交获得（Ramseyand

Schemske，1998；吴雪娟等，2016）。根据遗传效应不

收稿日期：2017-10-25

基金项目：海南省自然科学基金项目（317281）作者简介：张源源（1989-），主要从事橡胶树多倍体育种和诱变育种研究工作，E-mail：yuanyuanhill@sina.com。

2期张源源等：橡胶树三倍体的2n配子来源及发生途径鉴定

·209·同，2n配子发生途径可分为第一次减数分裂核复原（Firstdivisionrestitution，FDR）和第二次减数分裂核复原（Seconddivisionrestitution，SDR）两种，其中FDR途径可传递亲本70%~80%的杂合性，SDR途径可传递亲本30%~40%的杂合性（康向阳和王君，及其母本GT1和父本PR107。云研77-2和云研77-4是从GT1×PR107双无性系自然授粉的杂交子代中通过苗期耐寒筛选获得（李惠波等，2009）。高效植物基因组DNA提取试剂盒（DP350）购自天根生化科技（北京）有限公司；Hi-Di去离子甲酰胺、POP-7Poly-2010），传递亲本杂合性的差异决定了不同发生途径2n配子在多倍体育种中具有不同的应用价值。因此，研究橡胶树三倍体的2n配子来源及发生途径对利用其亲本开展多倍体育种具有重要意义。【前人研究进展】分子标记是2n配子来源及发生途径鉴定的常用手段之一，通过筛选亲本中的杂合性标记位点，对其2n配子中的等位基因配置进行比较分析，可快速确定2n配子的遗传组成（张正海和康向阳，2006）。Chen等（2008）应用4个SSR标记分析鉴定出柑橘异源三倍体来源于FDR途径产生的2n雌配子。Ferrante等（2010）通过多个柑橘二倍体亲本与四倍体品系杂交获得了四倍体子代，并应用6个SSR标记研究鉴定其2n配子的发生途径，结果发现不同亲本分别通过不同发生途径（FDR或SDR）产生杂合或纯合的2n配子。Xi等（2012）应用21个SSR标记分析鉴定出3株黑杨异源三倍体均来源于FDR途径产生的2n雌配子。Dong等（2014）、旻昱等（2017）研究表明，采用少量位于着丝粒附近的低重组率SSR分子标记可检测青杨杂种多倍体的遗传组成，也可鉴定出毛白杨杂种三倍体的2n雌配子来源及发生途径。Yao等（2016）应用25个SSR标记鉴定出通过SDR途径产生的2n雌配子是橡胶树GT1自然授粉子代三倍体的唯一来源。【本研究切入点】橡胶树云研77-2和云研77-4具有较母本GT1生长速度快、产量高、抗性强（敖硕昌等，1998）和高度不育的特性（李惠波，2006），经染色体计数确认为纯合三倍体，是世界上唯一大面积种植且应用于生产的多倍体橡胶树（李惠波等，2009）。由于橡胶树纯合三倍体的唯一来源途径是2n配子和n配子杂交，但目前尚无形成云研77-2和云研77-4的2n配子来源及发生途径的相关研究报道。【拟解决的关键问题】以三倍体橡胶树云研77-2和云研77-4及其亲本为试验材料，通过SSR分子标记鉴定形成其三倍体的2n配子来源及发生途径，分析2n配子传递亲本的杂合性，为解释云研77-2和云研77-4具有优良性状的原因及利用其亲本的2n配子杂交选育多倍体新品种提供参考。

1材料与方法

1.1

试验材料

供试材料为三倍体橡胶树云研77-2、云研77-4

mer、GS-500LIZ分子量内标、毛细管电泳10×Buffer和2×TaqPlusPCRMasterMix购自AppliedBiosys-tems公司。1.2

试验方法

1.2.1

基因组DNA提取

称取云研77-2、云研77-4、母本GT1和父本PR107的嫩叶300mg，参照高效植物基因组DNA提取试剂盒使用说明提取基因组DNA。1.2.2

SSR引物筛选及合成

通过毛细管电泳检

测，从30对在橡胶树中具有多态性位点的引物中，筛选出13对本研究对象中具有多态性的引物，其序列及文献来源见表1。引物5'端连接TAMRA、HEX、FAM或ROX荧光标记，并由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。1.2.3

PCR扩增

反应体系10.0μL：DNA模板

0.5μL，TaqPlusPCRMasterMix5.0μL，10μmol/L上游引物0.1μL，10μmol/L下游引物0.1μL，无菌水补足10.0μL。扩增程序：94℃预变性5min；95℃30s，50~60℃30s，72℃30s，进行35个循环；72℃延伸10min。PCR产物于4℃保存。1.2.4

毛细管电泳检测和SSR分析

4种PCR产物

TAMRA、HEX、FAM和ROX荧光标记）各0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合后加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却，于ABI-3730XL基因分析仪上检测。检测结果使用Gene-MarkerV2.20读取分析。1.2.5

2n配子来源和发生途径鉴定

理论上，不

考虑无效等位基因和等位基因丢失的情况，三倍体含有提供2n配子亲本的2个及以上等位基因。因此，当同一亲本所有的基因位点均与三倍体子代含有2个及以上相同等位基因时，可确定该亲本为三倍体的2n配子供体。不考虑同源重组的情况下，FDR途径产生的2n配子含有亲本的所有等位基因，SDR途径产生的2n配子含有亲本50%等位基因。因此，确定2n配子来源后，若三倍体在所有的基因位点均含有提供2n配子亲本的所有等位基因时，则2n配子发生为FDR途径，反之为SDR途径。如图1所示，在HSSR013位点，母本GT1等位基因为abc，父本PR107的等位基因为bb，云研77-4的等位基因为abbc，可判

（即连接·210·表1SSR引物序列及参考文献来源

Table1SSRprimersequenceandreferencesources

位点LocusHB-1HSSR006HSSR012HSSR013EHB034EHB070EHB087EHB133EHB159EHB177EHB065

unigene17757HESR055

南方农业学报49卷引物序列Primersequence

F：5'-CTGATGCTGCCAAGCAATAC-3'；R：5'-CAAACATCGCACTCTCCTCA-3'F：5'-ACCTCGATCCACAAACGAAC-3'；R：5'-CTGAGGGCGTAAGAATCGAA-3'F：5'-CCGCCTCAAGAAGAACAAAG-3'；R：5'-TCCCCTCGAGAGCTTATCAA-3'F：5'-CCGGGATGATTTTGAGAAAG-3'；R：5'-GATCCTGAAGCTCTGAGAGAA-3'F：5'-ATAGCCGACCCCAAATTCTT-3'；R：5'-GGACAGCAAGACATGAAGAGTG-3'F：5'-CCCCACATGCGATTTAAGTT-3'；R：5'-TGGGCTGTGTTGTGCTATTC-3'F：5'-CGGAGCTAAGTTCGAGTCCTT-3'；R：5'-CTGGAACCGTATTTCCAGGT-3'F：5'-GGCCATCACTCAACATCCTT-3'；R：5'-CTCACCCTTTTGAAAGCGAA-3'F：5'-TACCAAGCATGTTGCCCATA-3'；R：5'-TCTCAGAAACAAGGGTTGGG-3'F：5'-TCGCTTTCTCCATATAGAGTTTCA-3'；R：5'-CAGCAAGAAATCCCTCAACC-3'F：5'-CCAGTGAGCACAGGCATAAT-3'；R：5'-TGGAGAGTGCAGATGAATGC-3'F：5'-GACTTGCCTCTCCCAGACC-3'；R：5'-CCTTATCCTATCTTTTGTTTTCC-3'

F：5'-TTGCTGAGATGTGATG-3'；R：5'-GAGGTTTAACTGCTAAG-3'重复单元

Repeatunit（TG）n（CG）n（GAT）n（CT）n（AGTTG）n（AAG）n（ATT）n（CTT）n（CA）n（GAA）n，（TTC）n（AAT）n（GA）n（GAA）n

文献来源

ReferenceSouzaetal.，2009安泽伟等，2009安泽伟等，2009安泽伟等，2009Triwitavakornetal.，2011Triwitayakornetal.，2011Triwitayakornetal.，2011Triwitayakornetal.，2011Triwitayakornetal.，2011Triwitayakornetal.，2011Triwitayakornetal.，2011

Lietal.，2012Anetal.，2013

断2n配子来源于母本GT1，且云研77-4含有亲本GT1

的所有等位基因，可判断2n配子发生途径为FDR。

2608.0006.0004.0002.000

0

GT1

a

265

HSSRO13270

275b

280

2结果与分析

2.1

基因组DNA提取结果

4个供试材料的基因组DNA浓度为68.55~335.15ng/μL，OD260/OD280为2.007~2.119，其琼脂糖凝胶电泳检测结果（图2）表明，提取的基因组DNA质量较好，条带完整，可用于后续试验。

M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

c

266.9

260

6.000

5.0004.0003.0002.0001.000

0

PR107

265

270

274.4276.3275bb

280

274.5

260

6.0004.0002.000

0

266.7

274.2276.2

a

云研77-4

265

270

275bb

c

280

图2基因组DNA扩增电泳结果

Fig2GenomicDNAamplificationelectrophoresisresults

M：DNAMaker；1~5：其他橡胶树品系；6：PR107；7：GT1；8：云研77-4；9：云研77-2M：DNAMaker；1-5：Otherrubbertreestrains；6：PR107；7：GT1：8：Yunyan77-4；9：Yunyan77-2

图1

云研77-2、云研77-4及其亲本在HSSR013位点的等位

基因配置

Fig.1AllelestatusofYunyan77-2，Yunyan77-4andtheirpa-rentsatlocusHSSR013

2.2

1.2.62n配子传递亲本杂合性分析在确定2n配

子来源及发生途径后，可直接读取2n配子的基因型，计算2n配子传递亲本的杂合性（Rateofmaternalheterozygosity，HR）。2n配子传递亲本的杂合性计算公式为：

HR（%）＝nab（/nab+naa+nbb）×100

其中，n为2n配子数，ab表示杂合基因型2n配子，aa和bb表示纯合基因型2n配子（Xieetal.，2014）。

SSR引物筛选结果

毛细管电泳检测结果表明，从30对引物中筛选出的13对引物在三倍体云研77-2和云研77-4中处于杂合状态且在其父母本中具有差异条带，筛出率为43.33%（表1）。利用13对引物对4个供试材料进行PCR扩增，共扩增出33条差异性条带，平均每对引物扩增出2.5个条带，每个位点的等位基因数为2~3个，其中6个位点有2个等位基因，7个位点有3个等位基因。2.32n配子来源鉴定结果

如表2所示，通过HB-1、HSSR012、EHB133和EHB177位点可判定形成云研77-2的2n配子来源于