A．①与③是由相同限制酶切割产生的 B．DNA连接酶可催化①与③的连接 C．经酶切形成④需要脱去2分子水
D．DNA连接酶与DNA聚合酶均能作用于上述黏性末端 答案 B
解析 ①与③的黏性末端相同，但它们识别的碱基序列不同，应不是相同的限制性核酸内切酶切出来的， A项错误；酶切获得④需要消耗2个水分子，C项错误；DNA聚合酶作用的是单个游离的脱氧核苷酸， D项错误。
方法链接 黏性末端或平末端是否由同一种限制酶切割形成的判断方法
将黏性末端或平末端之一旋转180°后，看它们是否是完全相同的结构。是，则为相同限制酶切割形成的；否，则为不同限制酶切割形成的。 三、基因进入受体细胞的载体
1．种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。 2．常用载体——质粒
(1)本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。 (2)质粒作为载体所具备的条件及原因
条件 稳定并能自我复制或整合到染色体DNA上 有一个至多个限制酶切割位点 具有特殊的标记基因 无毒害作用 (3)作用
①作为运输工具，将目的基因导入受体细胞。 ②质粒携带目的基因在受体细胞内大量复制。 归纳总结
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原因 能使目的基因稳定存在且数量可扩增 可携带多个或多种外源基因 便于重组DNA的鉴定和选择 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤 1．作为载体必须具备的条件
(1)必须有一个至多个限制酶切割位点。
(2)必须能在受体细胞中稳定存在并具备自我复制的能力，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA同步复制。
(3)必须有标记基因，便于筛选和鉴定。 (4)对受体细胞无害。
(5)载体的大小适合，便于提取和在体外进行操作。 2．标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。 将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了基因表达载体的受体细胞。如下图：
例5 质粒是基因工程最常用的载体，下列关于质粒的说法正确的是( ) A．质粒在宿主细胞内都要整合到染色体DNA上 B．质粒是独立于细菌拟核DNA之外的小型细胞器 C．基因工程使用的质粒一定含有标记基因和复制原点 D．质粒上碱基之间数量存在A＋G＝U＋C 答案 C
解析 基因工程使用的载体需有一至多个酶切位点，具有自我复制的能力，有标记基因，对受体细胞安全，且分子大小适合。质粒进入宿主细胞后不一定都要整合到染色体DNA上，如宿主细胞是细菌细胞则不需整合。质粒是小型环状双链DNA分子而不是细胞器，也不会有碱基U。
例6 质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是( )
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① ② ③
A.①是c；②是b；③是a B．①是a和b；②是a；③是b C．①是a和b；②是b；③是a D．①是c；②是a；③是b 答案 A
解析 ①细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因没有被破坏，所以插入点是c；②细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因正常而抗四环素基因被破坏，故插入点为b；③细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，能在含四环素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因被插入而破坏，故插入点为a。 易混辨析 细胞膜上的载体与基因工程中的载体比较
(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。
(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
基因工程的基本工具
细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 能生长 能生长 不能生长 细菌在含四环素的培养基上的生长状况 能生长 不能生长 能生长 ??作用：识别③双链DNA分子中某种特①限制性核酸内切酶(分子手术刀)? 定的核苷酸序列，并切割特定部
位的④磷酸二酯键??结果：产生⑤黏性末端或平末端
来源：主要从②原核生物中分离纯化出来
7
??TDNA连接酶
⑥DNA连接酶?分子缝合针??作用实质：在两个DNA片段之间
?? 形成⑦磷酸二酯键
4
常用种类：E·coliDNA连接酶、
⑧载体?分子运输车
???动植物病毒等
?能在受体细胞中复制并稳定保存；
?????具有?一个至多个限制酶切割位点，
?供外源DNA片段插入其中；
?必备条件?具有
?标记基因，供重组DNA的鉴
???定和选择
?
常用载体：⑨质粒、⑩λ噬菌体的衍生物、
1．下列说法中不正确的有( )
①限制酶主要是从真核生物中分离纯化出来的 ②DNA连接酶都是从原核生物中分离得到的 ③所有限制酶识别的核苷酸序列均由6个核苷酸组成 ④不同限制酶切割DNA的位点不同 ⑤有的质粒是单链DNA A．①②④⑤ C．②③④⑤ 答案 B
解析 限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，有很少量是来自真核生物——酵母菌，①错误；T4DNA连接酶来源于T4噬菌体(一种病毒)，②错误；EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶识别的序列均为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成，③错误；不同限制酶切割DNA的位点不同，切割出不同的黏性末端或平末端，④正确；所有的质粒都是双链的环状DNA分子，⑤错误。
2．下列所示的末端至少是由几种限制酶作用产生的( )
B．①②③⑤ D．①③④⑤
A．1种 B．2种 C．3种 D．4种 答案 C
解析 图中③④为相同的平末端，可能由同一种限制酶切割所得，故图示四种末端至少是由
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