人类X染色质的制备与观察

人类X染色质的制备与观察

山东大学11级

摘要 人类X染色质（巴氏小体）是由雌性哺乳动物体细胞中失活的X染色体在间期细胞核中呈异固缩状态（染色质高度螺旋化），贴近于核膜边缘的染色小体，其观察和研究在遗传学中具有重要意义。（引用课件）本实验中，以人口腔颊部上皮细胞与发根毛囊细胞作为材料进行硫瑾染色。通过实验，我掌握了鉴定人类X染色质的方法，在显微镜下观察了巴氏小体的所在部位和形态特征；并了解了X染色体失活的有关假说。

1. 引言

1949年，加拿大学者Barr在雌性猫的神经元细胞核中发现一种染色很深的小体（现在称为巴氏小体），而在雄性猫中则极少出现。此后的研究表明在哺乳动物体细胞间期细胞核中，除一条X染色体外，其余的X染色体失活并呈异固缩状态，即为巴氏小体，又称X小体、性染色质，直径约1μm，通常位于间期核膜边缘，在DNA复制期表现为晚复制。巴氏小体的数目=X染色体数目—1。

关于X染色体失活，Lyon M．F 于1961年提出Lyon假说，主要内容有：

①雌性哺乳动物的两条X染色体中，只有一条X染色体有转录活性，另一条X染色体无转录活性，呈固缩状，形成X染色质。

②失活发生在胚胎发育早期。 ③失活是随机的。

Lyon假说虽然可以解释一些问题但不是全部。例如XO的Turner综合征患者会有各种异常。多X患者还会有各种异常，而且X染色体越多症状越严重。

Lyon假说的补充：X染色体非随机失活。生殖细胞中不发生X染色体失活。失活的X染色体上有活性基因与失活基因镶嵌存在。

因为X染色体的失活是个比较复杂的生物学问题，目前对这一现象仍然存在着一些难以解释的疑点。在临床和法医学上可用巴氏小体鉴定性别。

在本次实验中，通过对口腔颊部上皮细胞与发根毛囊细胞的染色制片，可以观察巴氏小体在细胞中的分布和形态。其参考值为：正常女性口腔粘膜细胞中，X染色质约15%左右，平均16.4%，不超过30～35%，仅含1个X染色质。 男性只有0～3%，平均0.7%。

2.实验材料

2.1实验材料

生物材料：人体口腔颊部上皮细胞，人体发根毛囊细胞。

仪器及试剂：显微镜、解剖针、牙签、镊子、载玻片、盖玻片、硫堇、1mol/L HCl、蒸馏水、45%醋酸、95%乙醇。 2.2 实验方法

2.2.1观察人口腔颊部上皮细胞巴氏小体

刮取颊部粘膜上皮细胞（用牙签刮取口腔上皮细胞，取第五次刮下的细胞）→涂片，晾干→1MHCl解离10分钟→弃去HCl，水洗3次（在片子反面冲水）→用硫堇染色5-10分钟→用95%乙醇漂洗→晾干→镜检 2.2.2观察发根毛囊细胞巴氏小体

拔取带毛囊头发一段→45%冰醋酸解离5分钟→剥取毛囊→硫堇染色→压片观察（压片前可先用解剖针敲片，使细胞分散）。 2.2.3镜检

在40倍显微镜下选择核质染色呈网状或颗粒状、核膜清晰、无缺损、染色适度、周围无杂质的细胞观察。观察巴氏小体的有无、存在部位及形态。

3.实验结果

在本次实验中，我分别选取了口腔颊部上皮细胞与发根毛囊细胞进行实验。但以口腔颊部上皮细胞作为材料时，由于口腔未完全洗漱干净，有食物残渣及其他杂质，故制片观察时视野中杂质非常多，且上皮细胞数目十分稀少，很难找到巴氏小体。 因为发根毛囊细胞材料比较容易获取，并且染色观察均更加方便。所以重点观察了毛囊细胞中的巴氏小体。在制片过程中，硫堇的染色时间最为关键。第一次制片时，染色5分钟，导致染色颜色过深，影响实验观察，视野中仅一处染色颜色最适合，观察到了巴氏小体。

巴氏小体

染色5min

为了防止染色过量，我分别采取了不同措施进行制片。

①染色5分钟后用乙醇进行脱色，再压片观察。此时观察到的细胞中巴氏小体较为明显。

②仅染色2分钟。由于染色时不是很均匀，导致片子部分染色过深，但大部分染色颜色适度。（图片拍摄不是很清楚，巴氏小体比较模糊。）

4.讨论

结果分析：巴氏小体在显微镜下为一结构致密的浓染小体，一般靠近核膜处，约1-1.5微米大小。形状多样有卵圆形，三角形，月牙形，线性等。本次实验中未使用油镜观察，故巴氏小体的形状观察得不是很清楚，为一小点状。

在毛囊细胞巴氏小体的观察中，取一个视野下的细胞进行计数，含巴氏小体的细胞9个，未观察到巴氏小体的细胞计数结果为45个，巴氏小体出现频率约为20%，符合正常值。

操作分析：

本次试验中对口腔上皮标本都进行了硫堇染色法观察，其操作过程引入杂质较多，导致显微镜视野中不够整洁，严重影响观察。

在以毛囊细胞为材料时，硫堇的染色时间十分关键。因为本次实验中使用的硫堇浓度较高，故应适当减少染色时间，以获得最佳染色效果。也可以用乙醇进行脱色，脱色后的颜色为蓝色。

总结：

本次实验的难点在于标本杂质的控制及染色时间的把握。 1.载玻片要非常干净，洗净酒精浸泡后晾干或烤干，减少杂质。

2.实验前先用水将口漱净，第一遍刮取的样本弃去，尽可能除去口中杂物。注意不要刮破上皮，涂片后要等材料晾干后在染色或解离，否则丢失材料。 3.勿使样品中混入其他细胞（如内层毛囊细胞）。

4.视硫堇浓度确定染色时间，否则造成染色过浅或背景着色皆影响观察。

5.在涂片法中冲洗玻片时,应将玻片倾斜成45 ℃,用细水流从玻片的一端将染色液冲洗干净,并且要在完全干燥之后才能进行镜检,因为未干燥的玻片会使显微镜的物镜受到污染。