固定化酶的评价指标有哪些？
常用的评估指标有：固定化酶的活力：是指固定化酶催化某一特定化学反应的能力，其大小可用一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示；固定化酶的活力回收：是指固定化后固定化酶的总活力占用于固定化的游离酶总活力的比例；偶联效率：载体上固定的蛋白量占加入蛋白总量的百分比。（加入蛋白活力-上清液蛋白活力）/加入蛋白总活力*100%；相对活力：固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中末偶联的酶活力）*100%；半衰期：是指在连续测定条件下，固定化酶的活力下降为最初活力一半所历经的连续工作时间，为衡量其稳定性的指标。
为什么固定化酶在一般情况下会比游离酶更加稳定？
① 固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子的伸展变形（空间自由度受限，刚
性增加，空间结构不易变----稳定） ② 酶活力的缓慢释放 ③ 当酶与固态载体结合后，失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了酶的降解
固定化酶的性质发生变化体现在？米氏常数Ｋｍ值的变化（见课本Ｐ４４）。
性质变化体现：酶活力一般都下降，稳定性一般上升，最适pH改变（附：最适温度
提高）
固定化酶的表观Ｋｍ随载体的带电性能变化：（表观Km值指的是测出来的Km值,不一定是实际的.比如包埋后的酶可能性质不变,但Km会由于传质效应而测出来上升,这时由于酶的性质不变,实际上km是不变的.）
固定化共价固定的活化基团方法举例?
载体上常用的功能基团包括:芳香氨基,羟基，羧甲基，氨基等
可以与载体结合的酶的功能基团包括：氨基，羧基，巯基，羟基，咪唑基，酚基等
酶的固定化方法有哪些分类?其中可用于共价结合的酶的功能团有哪些？ 酶的固定化方法通常按照结合的类型进行分类：
① 非固定结合法：包括结晶法、分散法、吸附法分为物理及离子吸附法；②化学结合法：包括交联法、共价结合法；③包埋法：包括微囊型和网格型。
其中可用于共价结合的酶的功能团有氨基,羧基,巯基,羟基,咪唑基,酚基等。
酶的固定化方法主要有：共价结合固定法，和非共价结合法。
非共价结合法包括：结晶法；分散法；物理吸附法；离子结合法 结晶法局限性是:在不断的重复循环中,酶会有所损耗.
物理吸附法 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构变化少，因而酶活力损失很少。
缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等。
共价结合法：主要有二种
①将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应； ②在载体上接上一个双功能基团，然后将酶偶联上去。 活化载体的方法：重氮偶联法;溴化氰法 ? 优缺点：
? 优点：与酶结合牢固，不容易脱落；
? 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，容易引起酶失活，酶活回收率低，甚至底物的专一
性等也会发生变化。
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交联法属于共价结合法，但无载体，最常使用的交联剂是：戊二醛。降低交联剂浓度
和浓缩反应时间将有利于固定化酶比活的提供。
，固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
固定化酶的活力一般比天然酶小，原因：①固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；②固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），影响到活性中心与底物的定位作用；③内扩散阻力使底物分子与活性中心接近受阻；④包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接触。
在大多数情况下酶经过固定化后其稳定性都有所提高，表现在热稳定性提高；对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高；对不同pH稳定性、蛋白酶稳定性、贮存稳定性和操作稳定性都有影响。原因：①固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变性；②酶活力的缓慢释放；③当酶与固态载体结合后，失去了分子间相互作用的机会，从而抑制酶的自降解。
影响固定化酶性能的因素 (一)质量传递效应:
? 由于空间位阻、离子强度变化或其他因素导致溶质在反应体系中运动性能受到影响，
这种现象称质量传递效应。
? 对于固定化酶，由于质量传递效应能引起反应速率的降低，因此和天然酶相比，其催
化效率有所降低。
? 增强催化效率的一些方法：
① 降低颗粒大小；
② 对于比活力高的酶应降低酶的负载量； ③ 使酶在载体的外部优先结合。
第三章 酶的化学修饰
化学修饰:凡通过化学基团的引入或除去,而使蛋白质共价结构发生改变,称为蛋白质的化学修
饰.
选择性化学修饰: 利用化学试剂对肽链特定的基团的专一性修饰, 称为选择性化学修饰。 亲和修饰：修饰剂与底物有相类似的结构,对酶活性部位具有高度的专一性,能对活性部位的氨基酸残基进行共价标记,这类专一性化学修饰称为亲和化学修饰。 亲和试剂应具有的特性:
在使酶不可逆地失活前,亲和试剂要和酶形成可逆复合物; 亲和试剂的修饰程度是有限的;
没有反应的竞争性配体的存在应减弱亲和试剂的反应速度; 亲和试剂的体积不能太大,否则会产生空间障碍; 修饰产物应该稳定,便于表征和定量.
在蛋白质的化学修饰中，如何控制反应的专一性？
答：控制修饰反应的专一性一般从对试剂的选择、反应条件的选择和反应的专一性这几个方面去控制。
1.根据修饰的目的选择合适的试剂
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试剂的选择在很大程度上要依据修饰目的，这一般应考虑这些问题：如在反应条件下，修饰反应有没有限度、要完成的程度、对个别氨基酸残基是否专一及修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变、是否需要分离修饰后的衍生物；反应是否需要可逆、是否适合建立快速方便的分析方法等，在决定选择某一修饰方法之前，对上述问题必须有一个权衡的考虑。
2. 选择合适的反应条件
原则：允许修饰反应能顺利进行，同时不造成蛋白质的不可逆变性，有利于专一性地修饰蛋白质。因此对反应的温度、pH值、反应介质、缓冲液等都要根据以上原则进行考虑。
3.其他增强修饰反应专一性的方式 ① 利用蛋白质分子中某些基团的特殊性； ② 选择不同的反应pH值； ③ 利用某些产物的不稳定性； ④ 亲和标记； ⑤ 差别标记； ⑥ 利用蛋白质状态的差异。
如何控制酶修饰反应的专一性？
a) 依赖修饰的目的选择合适的化学修饰剂（举一两个例子） 一般地要考虑以下问题： i. 修饰反应要完成的程度； ii. 对个别氨基酸残基是否专一； iii. 在反应条件下，修饰反应有没有限度； iv. 修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变； v. 是否需要分离修饰后的衍生物； vi. 反应是否需要可逆； vii. 是否适合建立快速方便的分析方法。 b) 反应条件的选择（举一两个例子）
原则：允许修饰反应能顺利进行，同时不造成蛋白质的不可逆变性，有利于专一性地修饰蛋白质。因此对反应的温度、pH值、反应介质、缓冲液等都要根据以上原则进行考虑。
大分子化学修饰的优点：稳定性提高，体内半衰期延长，免疫原性和毒性降低或消除，提
高膜渗透性，提高疗效，增加在有机溶剂中的溶解度和耐有机溶剂变性的能力。
举例分析为什么要进行酶的化学修饰？
适当的化学修饰是提高酶稳定性、解除其抗原性、改变酶学性质（最适pH、最适温度、Km值、催化活性和专一性）的一种重要手段。
酶修饰的程度和部位的测定？
分析方法：光谱法（最简单，最有效）；间接法（最常用）
修饰对酶的性质的影响（是一般，不是一定）？
酶经过修饰后，其性质的变化包括：提供生物活性（包括某些在修饰后对效应物的反应性能改变）；增强在不良环境中的稳定性；针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫原性；产
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生新的催化能力。
蛋白质侧链主要功能基有:氨基,羧基,巯基,咪唑基,酚基,吲哚基,胍基,甲硫基等; 修饰反应主要有:酰化反应,烷基化反应,氧化还原反应,芳香环取代反应等;
利用具有两个反应活性部位的双功能基团使相隔较近的两个氨基酸残基之间或酶与其他分子之间发生交联反应，这种修饰方法叫化学交联。
简述酶的主要功能基团的修饰方法,每一种功能基团的修饰方法中的典型的一种 蛋白质功能基团的修饰包括有：
氨基：以卤代乙酸为修饰剂的烷基化的氨基。磷酸吡哆醛：325nm；三硝基苯磺酸：420nm和367nm；
羧基：水溶性的碳二亚胺类特定修饰酶的羧基；
巯基：有机汞试剂，如对氯汞苯甲酸对巯基修饰。N-乙基马来酰亚胺：300nm；对氯汞苯甲酸：250nm；5,5’-二硫-2-硝基苯甲酸：412nm；
咪唑基：以焦磷酸二乙酯（DPC）和碘代乙酸为代表的组氨酸咪唑基的修饰； 酚基：四硝基甲烷在温和条件下对硝化酪氨酸酚基的修饰；
吲哚基：以N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）为代表的色氨酸吲哚基的修饰；
胍基：以丁二酮为代表的具有二个邻位羰基的化合物的精氨酸残基的修饰； 甲硫基：经过氧化氢、过甲酸等可将硫醚氧化成甲硫氨酸桠枫。
第四章 酶蛋白的稳定性和稳定化
什么叫蛋白质的稳定性?如何理解蛋白质的稳定性这个概念? 影响蛋白质稳定性的主要因素有哪些?如何理解疏水性与蛋白质稳定性的关系?（疏水键内部规则排列越
高，稳定性越高）
蛋白质的稳定性: 蛋白质抵抗各种因素的影响,保持其生物活力的能力. 维持蛋白结构稳定的主要因素:
① 金属离子、底物、辅因子和其他相对低分子质量配体的结合作用 ② 蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用 ③ 盐桥和氢键 ④ 二硫键
⑤ 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 ⑥ 氨基酸残基的坚实装配 ⑦ 疏水相互作用
疏水性与蛋白质稳定性的关系
? 疏水性大小与稳定性没有必然的联系
? 非极性氨基酸在蛋白质球体内的规则的排列是稳定性的原因之一
? 增加疏水作用是稳定蛋白质的实用方法:降低蛋白质表面的疏水性,增加蛋白质内部的
疏水性
蛋白质稳定性的指标?热稳定性的衡量标准和稳定性的最有效指标是什么?（半衰期，熔化温度，变性剂浓度）
指标包括熔化温度Tm、蛋白质自由能、最大稳定性温度、在特定条件下蛋白质功能活性维持的时间；其中最有效指标熔化温度Tm、蛋白质伸展50%时的变性剂浓度
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