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2.2.2 合成干涉片段的退火
合成片段的退火体系：
sense antisense 10×PCR buffer dd H2O
各管混匀后90℃保温3分钟，37℃保温1h，再取5μL退火溶液加45μL 灭菌双蒸水混匀，使干涉片段终浓度为8ng/μL。
下面以一对DNA片段为例描述干涉片断退火过程。其退火过程见图2-2：
图2-2 干涉片段的退火 Figure 2-2 Anneal of DNA fragment
干涉片段1 2 μL 2 μL 5 μL 41 μL
干涉片段2 2 μL 2 μL 5 μL 41 μL
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2.2.3 重组载体的构建
2.2.3.1 pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒的大量提取
（1）将含有pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒的大肠杆菌接种入盛有200mL LB培养基（含2μg/mL氨苄青霉素）的500mL三角瓶中，置37℃振荡培养过夜（置摇床中160r/min）。
（2）实验前预先配制溶液Ⅱ，溶菌酶。预冷溶菌酶、溶液Ⅰ和溶液Ⅲ。取出菌悬液，观察菌体生长状况，将菌悬液分装于两个250ml离心桶中，调平。预冷离心机至4℃，4℃下8000r/min离心5min，弃上清，得菌体。
（3）加预冷的溶液Ⅰ50ml于每离心桶，混匀，洗涤沉淀。8000r/min离心5min，弃上清，得沉淀。此步骤的目的为出去培养基，以获得更纯的细菌沉淀物。
（4）用17ml溶液Ⅰ吹散重悬细菌沉淀物，加3ml新配制的溶菌酶溶液，温和混匀，室温放置10min，裂解大肠杆菌。
（5）加40ml新配制的溶液Ⅱ，以使菌体破碎，释放质粒DNA等内容物。缓慢颠倒数次，防止破坏基因组DNA，室温放置3min。
（6）加30ml预冷的溶液Ⅲ，缓慢颠倒数次，防止SDS破坏基因组DNA，冰浴放置15min，使蛋白质沉淀出来。4℃下以10000r/min离心10min，然后将上清液全部倒入新离心桶中。
（7）将上清液在4℃下以10000r/min离心10min，然后将上清液经8层纱布过滤至新离心桶中，以尽量除去蛋白质。
（8）加0.6倍体积（约54ml）的异丙醇，充分混匀，室温放置15min，以沉淀核酸。8000r/min离心15min，小心倒掉上清，敞开瓶口倒置于纸巾上，使残余上清液流尽，晾干。
（9）加15ml水再加15ml LiCl（预冷）混匀，静置沉淀15min，4℃下10000r/min离心15min，以出去蛋白质和RNA。
（10）倒上清于新的离心桶中，加30ml异丙醇，剧烈震荡，静置沉淀15min，在4℃下以10000r/min离心15min。再次沉淀核酸。
（11）弃上清，得到沉淀的核酸。敞开瓶口倒置于纸巾上使残余上清液流尽。 （12）用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下以10000r/min离心5min，弃去乙醇，离心桶敞口倒置于纸巾上，使乙醇挥发殆尽。此步骤可以沉淀DNA。
（13）加2ml无菌水溶解沉淀，将液体吸到10ml离心管中，再吸2ml ddH2O冲洗瓶壁，随后将洗液加到同一10ml离心管中，随后加100μl RNaseA，37℃，水浴30min。以使RNA彻底分解。
（14）加等体积含13％（w/v）聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，
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用微量离心机于4℃以12000转/分，离心15分钟，以回收质粒DNA。
（15）沉淀用3ml70%乙醇重悬清洗，以除去PEG，12000r/min离心8min。 （16）重复上步操作，将离心管倒扣于纸巾上10min，使乙醇挥发干净，加1ml H2O溶解，用等体积酚/氯仿/异戊醇再抽提一次蛋白质，室温下8000r/miin离心10min。质粒DNA溶解于酚相中，中层为蛋白质，下层为氯仿/异戊醇。
（17）小心吸上清与另一离心管中，加2倍体积的预冷无水乙醇，再加0.1体积的NaAC（3mol ，pH5.2）以除去酚，冰上沉淀20min，4℃下10000r/min离心15min，使DNA沉淀出来。
（18）去上清加入3ml 70%乙醇重悬清洗，10000r/min 离心15min，晾干，用500μl无菌水溶解沉淀。
测量OD260/280值及1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。 2.2.3.2 双酶切pRNAT-H1.1/shuttle-RFP载体 反应体系如下：
pRNAT-H1.1/shuttle-RFP（3.75μg/μL） 2μL HindⅢ （10U/μL） BamHI （10U/μL） 10×buffer tangoTM with BSA dd H2O
反应条件：37℃ 3h, 80℃ 20min 。 2.2.3.3 酶切产物的回收纯化
酶切产物分别经1%的TAE琼脂糖凝胶分离后，用DNA快速纯化回收试剂盒回收纯化，按照说明书操作： 试剂盒成分：
（1）纯化套件（吸附柱+收集管）：50套 （柱上含有树脂）。 （2）Buffer B2：30ml。
（3）Wash Solution：12ml，使用前加入48ml无水乙醇，充分混匀。 （4）Elution Buffer：5ml，可以用TE缓冲液或无菌水代替。 操作步骤：
（1）切取含DNA片段的琼脂糖（100mg～400mg）称重，按重量比1：3（切取重量：Buffer B2的体积比）加入Buffer B2。
（2）50℃水溶5-10分钟，胶完全溶化即可，其间可振荡助溶2-3次，待溶化后将溶液置于吸附柱中， 8000g/分 离心30s，若一次加不完，可分多次离心。
（3）倒掉液体，加入500μL Wash Solution于吸附柱中9000g/分，离心30s，弃液体。
1μL 1μL
2μL 14μL
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（4）重复步骤4。
（5）空吸附柱9000g/分再次离心1分钟，甩干剩余液体以除去残余酒精。 （6）将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖放置5～10分钟，使乙醇挥发殆尽。
（7）加入15～40μL Elution Buffer（60℃水浴Elution Buffer可提高得率），静置2分钟。
（8）9000g/分离心1分钟，管底溶液即为双酶切后质粒载体。 2.2.3.4 双切载体与干涉片段的连接
使连接反应体系中双切载体与干涉片段摩尔比为1:3，设计反应体系：
退火后干涉片段 10×buffer 双切P1.1载体
dd H2O T4DNA连接酶
P1.1-1 1μL 1μL 1μL 5μL 1μL
P1.1-2 1μL 1μL 1μL 5μL 1μL
负对照 1μL 1μL 6μL 1μL
反应条件：混匀后，16℃，12～16h。
注：以下分别将四组干扰片段构建重组质粒标记为p1.1-1、p1.1-2。 2.2.3.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
（1）从大肠杆菌JM109平板上挑取一个单菌落于3mL LB试管中，37℃振荡培养过夜。
（2）取0.4mL 菌液转接到LB液体培养基中，37℃培养2-3h。(此时，A600应在0.4-0.5之间，细胞数务必＜108/mL，此为实验成功的关键。)
（3）将菌液转移到50mL 离心管中，冰上放置10min。 （4）4℃离心10min（4000r/min）。
（5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽。
（6）用冰冷的0.1mol/L CaCl2 10mL悬浮细胞沉淀，立即放在冰上保温30min。 （7）4℃离心10min（4000r/min）。
（8）倒出上清液，用冰冷的0.1mol/L CaCl2 2mL悬浮细胞（务必放冰上）。 （9）分装细胞，每200μL一份，此细胞为感受态细胞。[32] 2.2.3.6 连接产物转化感受态大肠杆菌细胞DH5α
（1）从冰箱中取出一管（分装6管，每管100μL）感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
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