课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
一、预习与质疑（课前完成）
（一）预习内容 课本P21-26 （二）预习目标
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1．阐述选择培养基的应用原理；能根据各种微生物的代谢特征，配制选择培养基；
2．阐述土壤中分解尿素的细菌的分离与计数过程，列举其中涉及的相关技术并会用这些技术解决生产生活中的相关问题。
3．学会运用无菌技术完成微生物的分离、培养和技术各个环节。 （三）预习检测
一、理论基础
1．筛选菌株
(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于 生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时 或 其他微生物生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许 种类的微生物生长，同时 和 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。 （3）配制选择培养基的依据
根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养 微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养 微生物.加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。 2．统计菌落数目
（1）测定微生物数量的常用方法有 和 。 （2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理
当样品的 足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板进行计数。 3．设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中 对实验结果的影响，提高实验结果的 。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养 的培养基作为空白对照。
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二、实验设计（结合课题1学过的知识）
关于土壤中某样品细菌的分离与计数实验操作步骤如下：
1． 取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。应先 3 cm左右，再取样。 2．制备 ：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基
将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显 选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为 ，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
3．微生物的 与观察
将10g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中(体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液 ，转移至盛有 的无菌水大试管中，将土样以1、10、10…… 依次等比稀释至10稀释度，并按照由10～10稀释度的顺序分别吸取 进行平板涂布操作。每个稀释度下需要3个选择培养基、1个牛肉膏蛋白胨培养基。 将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养，及时观察和记录。 挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含 的培养基的斜面中，观察能否产生如教材中图2-lO的颜色反应。 4．细菌的计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在 的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出 ，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。
5．不同种类的微生物，往往需要不同的培养 和培养 。在实验过程中，一般每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以 。 6．本课题中的无菌操作还须注意什么问题？
（1） （2） （3） 7．在进行多组实验过程中，应注意做好标记，其目的是 。
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二、典例分析（课堂完成）
类型一 选择培养基的配制
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【例1】分析下面培养基的配方：KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H20、葡萄糖、尿素、琼脂。请回答：
(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别 和 。
(2)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用?如果具有，又是如何进行选择的?
解析：碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元素的物质。所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。绝大多数生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以这种培养基对微生物有选择作用。选择的原则是只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
启示：选择培养基筛选微生物的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 类型二 统计菌落数目
【例2】用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为10的培养基中得到以下几种统计结果，正确的是 ( )
A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、240和250，取平均值233
解析：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以 A、B不正确。C项虽涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。答案：D
启示：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组；在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需重新实验。
类型三 设置对照
【例3】用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是 ( )
A．未接种的选择培养基 B．未接种的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基 C．接种了的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基 D．接种了的选择培养基
解析：将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照遵循的原则是单一变量，所以与选择培养基一样接种、培养。答案：C
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三、检测与反馈（课堂完成）
1．下列哪种成分是选择分解尿素的细菌的培养基的特有成分（ ）
A.葡萄糖 B.琼脂 C.尿素 D.脲酶
2.下列关于测定土壤中细菌数量的叙述，正确的是 ( ) A．一般选用10～10倍的稀液分别涂布
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B．测定放线菌的数量，一般选用10、lO和10倍稀释 C．测定真菌的数量，一般选用10、10和10倍稀释
D．当第一次测量某种细菌的数量，可以将10～10倍的稀释液分别涂布到平板上培养 3.下列关于微生物的培养叙述错误的是( ) A．细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d B．放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7d C．霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d
D．不同种类的微生物，一般需要相同的培养温度和培养时间 4.下列可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是 ( ) A．以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂 B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂 C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂 D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
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5．科学家发现家蝇体内存在一种抗菌活性蛋白，这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者重视。 （1）分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的 、大小及形状不同，在电场中的 不同而实现分离。
（2）可用金黄色葡萄球菌来检验该蛋白的抗菌特性。抗菌实验中所用培养基中的牛肉膏和蛋白胨主要为细菌生长提供 和 。
（3）分别在加入和未加入该抗菌蛋白的培养基中接种等量菌液。培养一定时间后，比较两种培养基中菌落的 ，确定该蛋白质的抗菌效果。
（4）细菌培养常用的接种方法有 和 。实验结束后，对使用过的培养基应进行 处理。
6．某同学为了调查水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察与计数。请回答于此实验有关的问题：
（1）培养基中含有的蛋白质、淀粉分别为细菌培养提供了 和 。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是 和 。
（2）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是 。
（3）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于 中培养，培养的温度设定在37℃，要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种
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