新人教版2018-2019学年高二生物选修1专题5课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段

新人教版2018-2019学年高二生物选修1专题5课题2

多聚酶链式反应扩增DNA片段

1.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

2．PCR反应需要DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶等条件。

3．PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。

4．PCR每次循环都包括变性、复性和延伸三步。

5．DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。

一、PCR技术的原理

1．细胞内DNA复制的条件[填表]

原料 模板 酶 引物

2．PCR扩增的原理及条件

(1)概念：PCR即多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。 (2)原理：

①子链的合成：DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物，DNA合成的方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

②双螺旋的打开：DNA的热变性原理，即：

4种脱氧核苷酸 2条DNA的母链 解旋酶和DNA聚合酶 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 。

(3)条件：DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶、一定的缓冲溶液以及能自动调控温度的设备。

二、PCR的反应过程

三、PCR技术的实验操作 1．实验用具

(1)PCR仪：该仪器能自动调控温度，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。

(2)微量离心管：总容积为0.5 mL，实际上是进行PCR反应的场所。 (3)微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体。 2．注意事项

(1)为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。 (2)所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。

(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。 四、DNA含量的测定

1．原理：利用DNA在260_nm的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。 2．计算公式

DNA含量(μg/mL)＝50×(260_nm的读数)×稀释倍数。

1．PCR技术控制DNA的解聚与结合是利用了DNA的( ) A．特异性 B．稳定性 C．热变性 D．多样性

解析：选C DNA分子在80～100 ℃的温度范围内变性，双链解开成单链；当温度缓慢降低时，又能重新结合形成双链。

2．标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是( ) A．92 ℃、55 ℃、72 ℃ B．72 ℃、55 ℃、92 ℃ C．55 ℃、92 ℃、72 ℃ D．80 ℃、55 ℃、72 ℃

解析：选A 当温度上升到90 ℃以上(90～96 ℃)时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72 ℃左右(70～75 ℃)时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。

3．PCR实验中用到微量离心管、缓冲液和蒸馏水，使用前必须进行的关键步骤是( ) A．反复洗涤 B．用酒精擦洗

C．高压灭菌 D．在－20 ℃保存

解析：选C 在PCR实验中，为了避免外源DNA等因素的污染，微量离心管、枪头、缓冲液和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。同时也不能忽视其他操作步骤，如缓冲液和酶应该分装成小份，并且在－20 ℃保存。

核心要点一

| PCR扩增的原理和过程

PCR反应 加热至90 ℃以上时，双链全部解开 耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) RNA或单链DNA分子片段 两条子链都是连续合成 高温 1．生物体内的DNA复制与PCR反应的比较 解旋 酶 不 同 点 合成 子链 温度 相 同 点 2．PCR的反应过程

一条子链连续合成，另一条子链不连续合成 体内温和条件 引物 体内DNA复制 在解旋酶的作用下，边解旋边复制 解旋酶、DNA聚合酶 一小段RNA ①都需提供DNA复制的模板 ②都需要四种脱氧核苷酸原料 ③都需要分别与两条模板链相结合的两种引物 ④子链延伸的方向都是从5′端到3′端

(1)变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链，如图。

(2)复性：当系统温度下降至50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如图。

(3)延伸：当系统温度上升至72 ℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如图。

3．PCR反应的结果

从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数形式扩增。

[题组冲关]

1．PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是( ) ①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA ②PCR过程不需要DNA聚合酶

③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 ④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制 A．③④ B．①② C．①③ D．②④

解析：选C PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为20～30个核苷酸；②PCR过程中，DNA解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。

2．在进行DNA亲子鉴定时，需大量的DNA。PCR技术可以使样品DNA扩增，获得大量DNA克隆分子。该技术的原理是利用DNA的半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图，图中黑色长条是引物)。在很短的时间内将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需的遗传物质不再受限于活的生物体。

(1)PCR需要模板DNA、引物、______________________________和____________等条件，其中的引物实质上是一种________________________。

(2)图中的变性、延伸分别是指_________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(3)某样品DNA分子中共含3 000个碱基对，碱基数量满足：(A＋T)/(G＋C)＝1/2，若经5次循环，至少需要向试管中加入______个腺嘌呤脱氧核苷酸。(不考虑引物所对应的片段)

(4)若下图为第一轮循环产生的产物。请绘出以a链和b链为模板经PCR扩增的产物。

解析：(1)PCR技术中除需要模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸外，还需要耐热的DNA聚合酶等条件，其中的引物是一种单链DNA分子或RNA分子。(2)变性的实质是DNA双链解旋形成单链；延伸是以DNA单链为模板，按碱基互补配对原则合成子链的过程。(3)由(A＋T)/(G＋C)＝1/2可知A∶T∶G∶C