南方农业学报JournalofSouthernAgriculture10期2095-1191；ISSNCODENNNXAAB2017，48（10）：1741-1747DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2017.10.03·1741·http://www.nfnyxb.com茶树甲羟戊酸激酶基因CsMVK克隆
及表达特性分析
王鹏杰，陈
丹，曹红利，姚雪倩，陈
笛，杨国一，郑知临，叶乃兴*
350002）
（福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福州
摘要：【目的】克隆茶树甲羟戊酸激酶基因（CsMVK），分析其生物学信息及在不同组织及乌龙茶做青过程中的表达特性，为研究茶叶加工过程中香气形成机制提供参考。【方法】RT-PCR扩增CsMVK基因，应用生物信息学软件对其编码蛋白（CsMVK）的氨基酸序列进行预测分析，通过实时荧光定量PCR（qPCR）分析CsMVK在茶树不同组织及乌龙茶做青过程中的表达特性。【结果】克隆获得的CsMVK基因（GenBank登录号MF668187）全长1455bp，开放阅读框（ORF）长度为1164bp，编码387个氨基酸，蛋白质分子量41.18kD，理论等电点（pI）5.88。CsMVK蛋白具有GHMP_kinases_Ndomain和GHMP_kinases_Cdomain2个功能结构域，定位于细胞质中，不存在跨膜结构和信号肽。系统发育进化树分析结果显示，CsMVK与三七、常春藤的MVK聚为一类，表明茶树与三七、常春藤的亲缘关系最近。qPCR检测结果显示，CsMVK基因在果实中的表达量显著高于其他组织（P<0.05，下同），在不同组织中的表达量排序为：果实＞根＞叶＞茎＞花；在乌龙茶做青过程中，从鲜叶到晒青叶，CsMVK基因的表达量上升，晒青到一摇过程中表达量下降，经过3次摇青，其表达量持续升高并在杀青前达最大值，与其他做青阶段差异显著。【结论】CsMVK基因表达与茶叶香气品质形成有关。
关键词：茶树；甲羟戊酸激酶（MVK）；乌龙茶；做青；表达特性；香气中图分类号：S571.103.53
文献标志码：A
文章编号：2095-1191（2017）10-1741-07
Cloningandexpressionofmevalonatekinasegene
CsMVKinteaplant
WANGPeng-jie，CHENDan，CAOHong-li，YAOXue-qian，CHENDi，
*
YANGGuo-yi，ZHENGZhi-lin，YENai-xing
（CollegeofHorticulture，FujianAgricultureandForestryUniversity/KeyLaboratoryofTeaScienceatUniversitiesin
Fujian，Fuzhou350002，China）Abstract：【Objective】Mevalonatekinasegene（CsMVK）fromteaplantwascloned，anditsbiologicalinformation
andexpressionindifferenttissuesandOolongteaduringfinemanipulationprocedurewereanalyzed，toprovidetheoreti-calbasisforexploringtheformationmachanismofaromaduringteaprocessing.【Method】GeneCsMVKwasamplifiedbyRT-PCR，andtheaminoacidsequenceofitsencodedprotein（CsMVK）waspredictedbybioinformaticssoftware.Ex-pressionsofgeneCsMVKindifferenttissuesofteaplantandOolongteaduringfinemanipulationprocedurewereana-lyzedbyreal-timefluorescencequantitativePCR（qPCR）.【Result】Thefull-lengthcDNAofclonedgeneCsMVK（Gen-BankaccessionnumberMF668187）was1455bpinlength，containinga1164bpopenreadingframe（ORF）encoding387aminoacids.Theproteinmolecularwas41.18kDandtheoreticalisoelectricpoint（pI）5.88.ProteinCsMVcontainedtwofunctionaldomains，GHMP_kinases_NdomainandGHMP_kinases_Cdomainfunctionaldomain.Itwasprimarilylocatedincytoplasm，withnotransmembranestructureandsignalpeptide.ThephylogenetictreeanalysisshowedthatCsMVKandMVKofPanaxnotoginsengandHederahelixbelongedtothesamecategory，whichindicatedthatteaplant，P.notoginsengandH.helixhadtheclosestgeneticrelationship.AccordingtoqPCRdetection，expressionofgeneCsMVKinfruitwassignificantlyhigherthanthoseinothertissues（P<0.05，thesamebelow）.TheorderofgeneCsMVKexpressionlevelswasfruit>root>leaf>stem>flower.DuringfinemanipulationprocedureofOolongtea，expressionofgeneCsMVK收稿日期：2017-08-17基金项目：福建省“2011协同创新中心”中国乌龙茶产业协同创新中心专项项目（闽教科〔2015〕75号）；国家现代农业（茶叶）产业
技术体系建设专项资金项目（CARS-19）；福建农林大学科技创新专项基金项目（CXZX2016117，CXZX2017181）
作者简介：*为通讯作者，叶乃兴（1963-），教授，主要从事茶树栽培育种与品质调控研究工作，E-mail：ynxtea@126.com。王鹏杰
（1993-），研究方向为茶树栽培育种与生物技术，E-mail：494928025@qq.com
·1742·南方农业学报48卷up-regulatedfromleavestosolarwitheringanddown-regulatedfromsolarwitheringtofirsttumblings.Throughthreetum-blings，theexpressionofgeneCsMVKreacheditspeakbeforefixationandshowedsignificantdifferencewithotherstages.
【Conclusion】ExpressionofgeneCsMVKmightberelatedtoaromaformationinteaprocessing.
Keywords：teaplant；mevalonatekinase（MVK）；Oolongtea；finemanipulationprocedure；expressioncharacteris-tics；aroma
0引言
【研究意义】茶树［Camelliasinensis（L.）O.Kun-tze］属山茶科山茶属，为多年生常绿木本植物。我国
是茶树的故乡和茶文化发祥地，目前世界上有60个国家引种了茶树（叶乃兴，2010）。茶叶作为天然、健康且富有文化内涵的饮品，在人类生活中一直扮演着重要角色（叶乃兴，2010；王丽等，2016）。萜类化合物是茶叶的主要香气成分，对其品质有重要影响徐燕，2013）。萜类化合物合成途径复杂，主要通过甲羟戊酸（Mevalonatepathway，MVA）途径和2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（MEP）途径合成，均由多种酶参与合成调控。其中，存在于细胞质中的MVA途径参与倍半萜、三萜、类胡萝卜素等次生代谢产物的生物合成，对茶叶的香型和品质影响较大（张冬桃等，2015）。甲羟戊酸激酶（Mevalonatekinase，MVK）是MVA途径的关键限速酶之一，其作为MVA途径酶促反应中第一个ATP依赖酶，负责把三磷腺苷中的磷酸基团转移到MVA的第5位羟基上形成甲羟戊酸-5-磷酸并释放ADP，最终生成异戊烯焦磷酸（Isopente-nylpyrophosphate，IPP），该化合物是合成萜类物质的前体物质（PotterandMiziorko，1997；LangeandCroteau，1999；ChuandLi，2003a）。因此，开展茶树MVK基因的克隆及表达特性研究，对了解茶树萜类化合物的形成及茶叶香气的影响具有重要意义。【前人研究进展】自1994年Riou等首次从拟南芥中克隆出MVK基因以来，又陆续从甜瓜（Deleuetal.，2007）、玉米（Alexandrovetal.，2009）、长春花（Sim-kinetal.，2011）、丹参（Maetal.，2012）等多种植物中克隆获得MVK基因。Champanoy和Tourte（1998）将酵母MVK基因转入烟草，结果表明，其能加速烟草植株再生过程、侧芽生长和开花习性，并提高叶绿素和淀粉含量。Lluch等（2000）研究发现，拟南芥MVK基因在其根部和花序中表达较高，且MVK基因5'端序列-295~-194区域的调控元件影响MVK基因高表达。Schulte等（2000）将长春花MVK蛋白进行分离纯化，结果表明，MVK基因受代谢产物反馈抑制调节。乌云塔娜等（2014）对杜仲MVK基因启动子进行分析，发现其含有大量基本顺式调控元件TATbox、CAATbox及光响应、生长素响应等相关顺式调控元件。【本研究切入点】目前，鲜见有关茶树MVK基因克
隆及表达特性的研究报道，限制了对茶树萜类化合
物合成机理的深入研究。【拟解决的关键问题】克隆CsMVK基因，对其进行生物信息学分析，实时荧光定量PCR（qPCR）检测CsMVK基因在不同组织及乌龙茶做青过程中的表达特性，为研究茶叶加工过程中香气形成机制提供参考。
1材料与方法
1.1
试验材料主要试剂：多糖多酚植物总RNA提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；pEASYT?-T1载体、T1感受态细胞、TransTaqHiFiDNAPolymeraseTransstart?TipGreenqPCRSuperMix试剂盒和逆转录试剂盒购自全式金生物技术（北京）有限公司。1.2样品采集
于2016年9月上旬~2017年4月下旬从福建农林大学教学茶场中采集茶树品种铁观音植株的根、茎、叶、花和果实，用于不同组织MVK基因的表达检测，并采集其中小开面二三叶，按陈林等（2014）的方法进行做青，并分别对鲜叶、晒青叶及一摇后、二摇后、三摇后和杀青前的叶片进行取样，用于乌龙茶做青过程中的表达特性检测。上述样品均设3次重复，锡箔纸包裹标记，液氮速冻后于-80℃保存备用。1.3总RNA提取及cDNA合成
参照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明提取样品总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，使用逆转录试剂盒将其反转录合成cDNA。1.4CsMVK基因克隆
从铁观音茶树芽叶转录组测序的数据库（王鹏杰等，2017）中筛选出与MVK基因同源性较高的表达序列标签（EST）序列，并进行BLASTx比对分析，核查其是否具有完整开放阅读框（ORF），并设计其RT-PCR引物（表1）。RT-PCR扩增参考王鹏杰等（2017）的方法，以铁观音芽叶cDNA为模板，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。参照姚雪倩等（2017）的方法进行PCR产物回收、连接及转化，将阳性克隆送至上海铂尚生物技术有限公司测序。1.5生物信息学分析
在NCBI中搜索CsMVK基因ORF并进行同源性分析；利用ProtParam、TMHMM2.0、SignalP、SMART、
（10期王鹏杰等：茶树甲羟戊酸激酶基因CsMVK克隆及表达特性分析·1743·表1引物名称及其序列
Table1Primernamesandtheirsequences
引物名称PrimerCsMVK-RT-FCsMVK-RT-RCsMVK-qRT-FCsMVK-qRT-RCsGAPDH-qRT-FCsGAPDH-qRT-R
序列Sequence
5′-ATGGAGGTGAGAACAAGAGC-3′5′-ATCAGGACGAAGAGTGGAAG-3′5′-CAAAAGTTGGCCGGAACACA-3′5′-AGAATGGTCGCCACTTCGTT-3′5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3′5′-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3′
用途FunctionRT-PCRCsMVK基因qPCR检测内参基因qPCR检测
TargetP1.1Server、PORTER和SWISS-MODEL分别对CsMVK蛋白进行理化性质、跨膜结构、信号肽、功能域、亚细胞定位、二级结构和三级结构预测分析，并使用PyMOL编辑三级结构；采用MEGA5.0构建系统发育进化树。1.6qPCR检测
利用CsMVK-qRT-F和CsMVK-qRT-R引物（表1），参照Transstart?TipGreenqPCRSuperMix试剂盒说明对CsMVK基因在不同组织及乌龙茶做青过程的相对表达量进行qPCR检测，以茶树GAPDH为内参基因，其引物（CsGAPDH-qRT-F和CsGAPDH-qRT-R）见表1。采用2-??Ct法（Schafferetal.，2001）分析检测结果。通过Excel2013和GraphPadPrism6进行数据分析和制图，同时采用SPSS20.0进行差异显著性分析。
2结果与分析
2.1
CsMVK基因克隆及序列分析结果
以铁观音芽叶cDNA为模板，RT-PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，扩增条带长度约1400bp，与预期结果一致（图1）。测序结果经BLASTx比对显示，该序列全长1455bp，编码完整的MVK蛋白，与其他植物的MVK基因相似度极高，GenBank登录号为MF668187，包含1164bp的ORF189~1352bp），编码387个氨基酸（图2）。2.2CsMVK蛋白生物信息学分析结果
理化性质分析结果显示，CsMVK蛋白分子式为C1828H2954N782O482S17，分子质量为41.18kD，等电点（pI）为5.88，含有20种氨基酸，其中亮氨酸（Leu）、丙氨酸Ala）和丝氨酸（Ser）的比例较高，分别为11.9%（46个）、9.8%（38个）和9.6%（37个）；不稳定系数为30.26，总平均亲水性为0.166，疏水性域比亲水性域大，推测该蛋白为稳定的疏水蛋白。
跨膜结构和信号肽预测结果显示，CsMVK蛋白无跨膜结构和信号肽，属于在细胞内发挥生理作用的非分泌蛋白。亚细胞定位预测结果表明，该蛋白定位于细胞质，由此推测CsMVK在细胞质中合成后无蛋白转运，未分泌到细胞外而直接在细胞质中结M
1
2000bp
1000bp
图1茶树CsMVK基因PCR扩增结果
Fig.1PCRamplificationofgeneCsMVKinteaplant
M：DNAMarker；1：CsMVK基因GeneCsMVK
合底物生成甲羟戊酸-5-磷酸（Mevalonate-5-phos-phate，MVAP），为下一步合成萜类化合物共同前体
物质即IPP。
功能域预测结果表明，CsMVK蛋白由3个保守区组成，分别为低复杂度区域（Lowcomplexityregion，位于47~56aa）、GHMP激酶N端保守区（GHMP_ki-nases_Ndomain，位于131~212aa）和GHMP激酶C端保守区（GHMP_kinases_Cdomain，位于288~368aa），其中后面2个保守区为所有MVK蛋白共有的功能域，可结合底物和ATP并进行催化反应（图3）。
CsMVK蛋白的二级结构预测结果显示，无规则卷曲占44.19%，α-螺旋占40.83%，β-折叠占14.99%。利用SWISS-MODEL构建CsMVK蛋白的三级结构，基于人类MVK蛋白为模板进行建模，二者序列相似性达42.86%，GMQE值为0.70，表明预测结果较理想。使用PyMOL对其进行编辑，结果如图4所示，GHMP激酶保守区分别位于蛋白两端，能结合底物和ATP并进行催化反应，发挥功能性作用。2.3CsMVK蛋白系统发育分析结果
将CsMVK蛋白的氨基酸序列进行BLASTp比对，结果显示，其与马铃薯（XP_006361859.1）、番茄XP_004230181.1）、辣椒（XP_016538569.1）、芝麻XP_011092024.1）和烟草（XP_016441034.1）等植物MVK蛋白序列的相似性较高，分别为80%、80%、78%、78%和77%（图5）。
（（（（
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