死活细胞的鉴别

（一）、死活细胞的鉴别

生活细胞近似无色透明，用普通光镜无法观察其形态，需用相差显微 镜来观察。

染色排除法：组织培养中检查死活细胞最常用的是“染色排除法”这类方

法简单但不甚严格，它只能判断细胞的代谢死亡，不反映细胞能否增殖。由于未 经过固定、专门染色，所以看不到死活细胞的形态差别。 所用染料的分类：

一般的生物染料不能穿过活细胞膜只有细胞被固定或细胞膜被破坏，染 料才能进入细胞膜。

第一类 ：死细胞着色，使死细胞着色的大部分是酸性染料。它们不容易 穿透活细胞的质膜，进入胞内，但却能渗透死亡的细胞，使之着色。如①台盼兰 （Trypan blue）：0.5-1%的台盼兰，pH7.0-7.2，每毫升细胞悬液加 0.1ml 染液，2 分钟后镜检，活细胞没有染上，死细胞全部被染成蓝色。②苯胺兰(Aniline’ black)： 0.05%的苯胺黑以 1：10 的量与细胞悬液混匀，1-2 分钟后，死细胞被染成黑色。 ③伊红 Y：细胞悬液与细胞悬液混喝，2 分钟后死细胞被染成桃红色。等。 第二类：活细胞着色，多为碱性染料，如中性红、健那绿、亚甲蓝、甲苯 胺蓝等。它们是一些无毒或毒性很小的染料，由于电性吸引而堆积在细胞中某一 特定的结构上从而显色，即它们解离后带正电，其中有的染料可与胞内某些结构 专一性的结合。

①1%结晶紫染色生理

1%结晶紫盐水与细胞悬液 1：2 混合，立即镜检，或细胞被染成

蓝紫色，而死细胞不着色。属于活细胞染料。活细胞染料无毒，无物理、化学变 化，基本上不影响细胞的生命活动。

②用呀啶橙染色可以鉴别出细胞固定前的死活状态。

丫啶橙是一种与 DNA 和 RNA 都能结合的荧光染料，在兰光或紫外光激发 下，DNA 可激发出 530nm 的荧光发射峰，RNA 可激发出 640nm 的荧光发射峰， 它与双链 DNA 的结合方式是潜入双链之间，而与单链 DNA 和 RNA 则由静电吸 引堆积在磷酸根上。在蓝光的激发下，细胞核发亮绿色荧光，核仁和胞质 RNA

Page 9 发桔红色荧光。因此，原来的活细胞经固定、染色后细胞核呈亮绿色，核仁和散 布在细胞质中的 RNA 呈桔红色，胞质其余部分为淡红褐色。死亡的细胞，因物 质发生变形，其核呈暗绿色，胞质整个呈暗绿色。但丫啶橙的阳离子也可以结合 在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但由于经过细胞固定抑制了这种结合，从而主 要显示出的是 DNA 和 RNA 两种核酸。 本次实验即选用活细胞染料健那绿来显示线粒体。 （二）细胞核和染色体的染色

Giemsa 染色：姬姆萨是常用的染料，可观察核、染色体。

醋酸地依红染色：可显示有丝分裂染色体的微细结构，如次缢痕、染色质

丝的螺旋化等。该染料同时具有固定和染色的作用，因此也可用来坐快速检查有 丝分裂指数。（细胞涂片，0.075 mol 的 KCI 低渗 5-10 分钟，使细胞膨胀，染色 体分裂；甲醇固定 10 分钟，空气干燥，滴加 2%醋酸地衣红，染 10-20 分钟后即 可观察。

（三）细胞器的特殊染色

1、内质网的显示

早在 1945 年，有人用电子显微镜就观察到了小鼠成纤维细胞的内质网。之

后，观察内质网基本是采用电子显微镜。在 80 年代中开始发展了一些活细胞荧 光染料，又称“荧光探针”，为显示细胞内的模型结构，包括内质网，提供了新 的途径。

DiOC6(3):是一种亲脂性的阳离子荧光染料，可选择性的与负电性的膜结构

结合。在低浓度时仅能染出线粒体，细胞界限不清，较高浓度时（0.5-2.5μg/ml） 内质网染色最佳，而容媒体、高尔基体等均然浅色。 2、高尔基体的显示

在光镜下观察高尔基体可用景点的固定染色，也可用活细胞荧光染料。由于高尔 基参与分泌这一动态过程，对糖蛋白、糖脂进行加工、分选和运输，所以在活细 胞中研究其动态和三维结构具有重要的意义。

Baker 苏丹黑染色法：可用于组织块、体外培养的单层细胞的染色。染色结 果：高尔基体呈黑色囊泡，细胞核呈红色。

Page 10 活细胞中高尔基体染色：用荧光探针 NBD-hexanoic ceramide 进行染色。 溶酶体的显示：观察溶酶体可以用电子显微镜，也可以采用细胞化学的方 法来现实。比如，酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶。这部分内容在下学期讲。 3、线粒体的显示

线粒体（mitochondrin）:是细胞内一个极为重要的细胞器，是细胞内物质 氧化磷酸化产生能量的重要结构。 线粒体的形态结构和功能定位

光镜：多为粒状、杆状、线状。不同的细胞类型，不同的生理状况，其形 态大小也有所不同。

电镜：是由二层单位膜围成的膜性囊， ⑴． ⑵． ⑶． ⑷．

外膜与内膜不连接。 内膜是皱褶的。

内膜表面不光化的膜结构向内凹陷，形成嵴。

嵴上有基体微粒（上面有 ATP 酶，是偶联磷酸化的关键装置）。

⑸． 嵴间为基质，含蛋白质、脂类、DNA、RNA 和核

蛋白体。有关催化线粒体内各种生命活大过程所需的酶和辅酶，都分布在线粒体 的基质中。

细胞生命活动中需要的大约 95%的能量来自线粒体。所以说线粒体是一个重 要的细胞器。细胞的内外环境因素的改变，可引起线粒体结构和功能的异常。发 现和检查线粒体就显得十分重要了。但线粒体在动物死后极易产生变化，故取材 必须新鲜。

Page 11 实验三 健那绿染活细胞线粒体

原理：健那绿（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，具有脂溶性， 能跨过细胞膜，解离后，有染色能力的基团带正电，结合在负电性的线粒体内膜 上。内膜上的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，呈蓝绿色。而在胞质内染料

被还原成无色。

线粒体浸泡在染液中能维持活性数小时，使我们能够直接看到生活状态的线 粒体的外形，分布及运动。

试剂：0.2%Janus green B 0.1g 加温到 30-40℃，充分生理盐水 50ml 溶解。

（需新鲜配置，以保持被氧化的能力）

染色：1.培养的细胞或用牙签刮下口腔粘膜上皮细胞；

2.涂在干净的载玻片上；

2.滴加 0.2%Janus green 液，室温染 10 分钟，盖上盖玻片观察，注意在 盖玻片下放两根头发丝，避免细胞被压迫，并可存有较多的液体。 结果：线粒体呈蓝绿色，细胞质接近无色。

实验四 过氧化物酶的显示

微体:早在 50 年代初有人发现在动物的细胞内存在有一种微小的颗粒，它 多见于肝细胞和肾小球上皮细胞内，但也广泛分布在小肠、心肌、骨骼肌、肺、 肾上腺、附睾、神经、脊髓、脑等。在不同的组织中微体所含的酶也不同，如苹 果酸合成酶、过氧化氢酶、天东氨酸氨基转移酶等，过氧化氢酶是微体的标志酶。 在过氧化氢酶分子中，有两种酶活性，即过氧化氢酶活性和过氧化物酶活性。过 氧化物酶和过氧化氢酶两者具有相似的化学性质，它们像血红蛋白和肌红蛋白一 样，都属于血红蛋白素蛋白，具有相同的辅基，即铁卟啉或血红素。 过氧化氢酶可使过氧化氢分解成水和氧，

Page 12 2H2O2=2H2O+ O2

这个分应称为过氧化氢酶反应，过氧化氢酶因有这种分解作用而被划分为 分解酶类，也可把它看作是转移酶或岐化酶。

过氧化物酶对纯过氧化氢没有分解作用，但如果有合适的受体存在，则能催 化氧转移到受体上，而使受体被氧化，

H2O2+AH2=2H2O+A

这个反应称为过氧化物酶反应。过氧化物酶：又称过氧化酶（peroxidase） 过氧化物酶是一种氧化还原酶，它除了分布在髓性白细胞外，还广泛的存在于各 种组织细胞中。它的种类很多，如在牛奶中有乳-过氧化物酶、红细胞中的谷胱 甘肽过氧化物酶、酵母中的细胞色素 c 过氧化物酶等。

过氧化物酶的功能：是机体中的抗氧化酶，在防止氧代谢物的损伤中具有重要的 作用。

⑴ 过氧化氢对细胞有毒害作用，通过过氧化物酶的作用可清除过氧化氢，防止 其在细胞内聚集。

⑵ 参与肝、肾对有毒物质的解毒。 ⑶ 对细胞的氧张力具有调节作用。 ⑷ 可能参与核酸、脂肪和糖代谢。 反应原理:

过氧化物酶在分解H2O2的过程中，必须由过氧化物而来的氧进行氧化作用

的 。在反应中有两种底物，即受氢体与供氢体，前者的代表是过氧化氢，后者 的代表是联苯胺类的药。过氧化物酶的反应通式如下：

AH2（供氢体） +H2O2受氢体= A（供氢体的氧化物）+ 2H2O

过氧化物酶可将底物中的H2O2分解，产生新态氧，使无色的联苯胺蓝氧化为 蓝色的联苯胺蓝。

实验： 过氧化物酶的显示 原理：同上。

材料和方法：

材料：0.5%硫酸铜、1%联苯胺（含有 30%的H2O2）、0.5%藏红花、玻片、滴管、剪

Page 13 子、小鼠。 操作方法：

⑴ 涂片：剪小鼠尾部，取血涂片，晾干备用。

⑵ 在晾干的涂片上滴一滴 0.5%硫酸铜，染 2 分钟。

⑶ 倾去硫酸铜，滴加联苯胺冲掉硫酸铜，在加一滴新的联苯胺，染 2-5 分钟。 ⑷ 1%的藏红花复染。

⑸ 流水冲洗，晾干、镜下观察。

结果：粒细胞的过氧化物酶反应阳性，呈蓝色颗粒，细胞质为红色。 临床意义：主要用于定性、定位观察急性白血病及其鉴别诊断。 在正常血骨髓中：过氧化物酶阳性的主要是中性粒细胞。

中性粒细胞：原粒时 POX 为阴性，早幼粒时开始出现阳性反应，以后逐渐反 应增强。

嗜酸性粒细胞：P0X 可成团块状。 嗜碱性粒细胞：反应多为阴性。

单核细胞：阳性反应颗粒多为细小弥散。

病理：在急粒、慢粒时 POX 增强，在急单时 POX 减弱。

而在急性淋巴型白血病时，POX 是阴性，因此可以与急性粒细胞性白血 病和单核细胞型白血病进行鉴别。在慢性粒细胞性白血病中嗜碱性粒细 胞的 POX 反应呈阳性反应。