? 标有不同荧光的beads群在垂直或水平方向上的线形度可能不是很好，
比如说，FL3-%FL2显得有些不够补偿，软件之所以这样设置是因为这种补偿条件更适合于细胞；
? 在补偿的值设定后，荧光道数的平均差可能出现轻微变动，这是一种正
常现象；
? FL3-%FL4和FL4-%FL3的值在两次FACSComp中有可能出现相当大的变化，
这是因为每一次时间延迟的设置有可能不一样，尽管如此，每一次FACSComp所提供的补偿的值都是合适的。
如遇到下列两个情况中的任何一个，FACSComp将进入到手动调节的模式： 1.流速小于400粒子/每秒； 2.补偿自动调节的时间长于75秒 3.补偿的值超过50%
单击Manual键，出现Target Value窗口，根据target mean difference 调节Compensation，使得mean difference在Target Value±2的范围内。 ? 补偿调试成功后，FACSComp自动前进到灵敏度调试，单击Start键，开始调
试灵敏度；灵敏度的调试包括三个部分：荧光、侧向角散射光、前向角散射光
? 调试完成后，软件计算结果，并将所有的结果都Calib File或Calib
File.LNW中，同时给出一份Summary Report；
? 从支撑架上移走装有beads的试管，换上蒸馏水，并将功能键换成STAND BY； ? 单击 Next Assay 进行下一个Assay，如这是最后一个Assay，这个键会 换成Set Up，单击此键可直接进入Set Up； Optimization进入优化窗口；
Quit键，退出FACSComp。若你在设定打印参量时选择的是Print After Each Assay，软件开始自动打印Summary Report，或者，你也可以在File menu下选择Print来打印Summary Report。 Stop Run 终止程序
7.3.4
Optimization
在您准备获取样本之前，请务必选用合适的样本来调节一下您的仪器，使得仪器的设置对于您的样本来说是处于一个最佳的状态，这就是所谓的优化（Optimization）。您可以用CellQuest来实现您的优化，也可以在FACSComp中进行。
FACSComp为您提供了5个文件来保存优化后仪器的设置，每一个文件都有其相应的文件名及优化窗口，分别是：
Optimization 1：Save File Name = MultiTEST.opt Optimization 2：Save File Name = TriTEST.opt Optimization 3：Save File Name = SimulTEST.opt Optimization 4：Save File Name = ProCOUNT.opt Optimization 5：Save File Name = FastImmune.opt
您可根据需要选择文件名及优化窗口，选用合适的样本，对仪器作出适当的调节，例如，您可在Optimization 1窗口中选用CD3/CD8/CD45/CD4标记的细胞来调节FL3的阈值和SSC gain；您可在Optimization2窗口中选用CD4/CD8/CD3标记的细胞来调节FL3的阈值和SSC gain；您可在Optimization 3窗口中选用CD3/CD19标记的细胞来调节FSC和SSC gain、FSC的阈值、FL1和FL2之间的补偿；您可在Optimization 4窗口中选用nucleic acid dye/CD34/CD45标记的细胞来调节FSC和SSC gain、FL1的阈值。
总之，您必须在确保PMT的电压、阈值以及补偿都是最合适的情况之下才能进行获取。 7.4
Troubleshooting
解 决 办 法 将流速设到HI； 加多一滴beads到试管中； 混匀beads 重新准备beads悬液； 启用新的beads 按PRIME排除气泡 检查鞘液罐有无加压； 检查鞘液罐有无裂缝； 检查液流系统有无渗漏 症 状 原 因 不能自动调节流速小于400粒子/秒 PMT CaliBRITE beads太旧 流动室中有气泡 压力不稳定 FL4 PMT电压变化在unlabeled试管中错加了超过100 PerCP而不是APC APC-beads Lot ID输错了 检测不到APC 没有APC beads beads 滴加beads时没有混匀 红色激光器没有工作 软件没有在单个 beads上设门 时间延迟调校失败 不能自动调节补偿，或补偿大于50% FL3-%FL4和（或）FL4-%FL3的补偿大于50% 不能成功进行灵敏度的测试 重新准备unlabeled-beads和APC-beads悬液，重新运行软件 输入正确的APC-beads Lot ID 滴加APC beads 在滴加beads之前先混匀 确定在 BDMAC 或BDPAC control panel中选择了FL4 鞘液用错了 请选用BD的鞘液或自制的PBS 鞘液中有颗粒 更换鞘液的滤器； 鞘液在使用之前请先过滤 细菌污染了 进行月维护； 更换鞘液的滤器； 准备新鲜的beads APC beads的流速太低了 确定流速设定在HI； 增加一滴APC beads 信号超出范围： ? 鞘液容器的盖子没有拧紧； ? 将盖子拧紧； ? APC Lot ID输错了； ? 输入正确的APC Lot ID； ? FL4 PMT的设置不对； ? 手动调节FL4 PMT； ? FSC的信号小于150 ? 与BDIS联系； channel； ? 按PRIME排除气泡 ? 液流中有气泡 时间延迟调节完后，FL4 PMT平重复PMT的调节 均道数的变化大于5 流速小于400粒子/秒 将流速设到HI； 加多一滴beads到试管中； 混匀beads 使用了错误的混合beads 使用正确的混合beads 细菌污染 进行月维护； 更换鞘液的滤器； 准备新鲜的beads 流动室中有气泡 按PRIME排除气泡 压力不稳定 检查鞘液罐有无加压； 检查鞘液罐有无裂缝； 检查液流系统有无渗漏 鞘液的流速改变了（鞘液桶的盖拧紧盖子，检查有无渗漏，重新子松动或渗漏） 进行PMT和时间延迟的调节 混合beads放置时间太长 重新配置新的混合beads，在运行一次FACSComp Separation失败 输入正确的beads Lot ID CaliBRITE beads太旧 重新准备beads悬液； 启用新的beads 细菌污染 进行月维护； 更换鞘液的滤器； 准备新鲜的beads 使用了错误的混合beads 使用正确的混合beads 错误的测试脉冲（仅对于用正确的测试脉冲重试 FACScan） 流动室中有气泡 按PRIME排除气泡 压力不稳定 检查鞘液罐有无加压； 检查鞘液罐有无裂缝； 检查液流系统有无渗漏
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