个测序步骤独立，使错误的累积变得最低 以离对核酸碱基子敏的掺入可直感场一步步的洗脱过程Ion 接测定；在自第个人基因效应可导致错误累积；阅合成测然条件下进Torrent/三组测序仪晶体100-200 读高重复和同种多生命技术序法 行DNA合成代 （PGM） 管检聚序列时有潜在困公司 （不需要使测pH难； 用修饰过的值变碱基） 化 有潜力达到高读长；可以切断的核苷酸可能第纳米孔牛津纳米尚未定成本生产纳被读错方向；难于生gridION 外切酶电流 四孔公司 量 米孔；无需荧产出带多重平行孔代 测序 光标记或光的装置 学手段 DNA纳米球的运用，加上形态各异的阵列，使这种测序方法具有几个优势。DNA纳米球通过增加杂交位点的数量而增强了信号强度。DNA纳米球的大小与芯片上连接位点的大小相同，因而导致每个位点连接一个DNA纳米球。由于芯片上的位点大致彼此相隔1微米，所以有多达30亿的DNA纳米球可固定到宽1英寸长3英寸的硅芯片上。除了增加每张芯片上的测序片段的数量外，DNA纳米球的大小和间隔使得检测器像素使用最大化。与另外的二代测序技术比较，这种杂交芯片降低试剂耗费但增加通量或数据产出。
一旦DNA纳米球阵列芯片形成，可运用40个普通探针，联同标准锚定序列和延伸锚定序列进行杂交和连接检测。这40个普通探针分为两组，一组用于检测接头位点的5'端，一组检测接头位点的3'端。每组有5型，每型有4种普通探针。每一探针长9个碱基。探针特点见图3B。标准锚定序列直接与接头的5'或3'端连接，随后普通探针进行杂交和连接。延伸的锚定序列由兼并和标准锚定序列连接而成。这种组合的探针锚定序列连接方法（combinatorial probe-anchor ligation, cPAL）使序列读长由5个碱基增加到10个碱基，从而导致每个DNA纳米球有62到70个碱基被测序。图3B显示了标准和延伸锚定序列的结构。
图3. 完整基因组学公司的DNB阵列生产和cPAL技术的方案示意图。A.待测片段的设计，DNA纳米球的合成，用来放置纳米球规则排列的纳米阵列---这些可以显示DNA纳米球阵列的形成过程； B. 图示：用对应于一个独特接头位点的5个碱基的一组普通探针进行测序过程。图中也显示了标准锚定序列和延伸锚定序列。
每进行一个杂交和连接循环就要对带有DNA纳米球的芯片进行荧光成像，然后用甲酰胺溶液对DNA纳米球进行重建。这种循环被重复直到全部组合的探针和锚定序列被检测。这种方式减少了试剂消耗并去除了潜在的累积错误，而这样的错误可在别的测序技术中出现。
全基因组学公司通过对3个基因组重测序展示了他们的DNA纳米球阵列和组合的探针锚定序列连接技术，且平均每个基因组花费试剂4400美元。这3个基因组结果随后与以前的测序结果进行了比较。测序深度是45X到87X，基因组覆盖度是86%到95%。显然这种技术与Sanger/CE和第二代测序技术比较可大大增加了通量，但它也有几个不足。首先，环化片段的产生会导致基因组某些区域没有被充分显现，这样会导致后续的基因组组装工作并不完整。再者，环化测序片段的大小（~400碱基）以及非常短的读长（~10碱基）妨碍了对基因组完全的和精准的组装，因为这些环化片段常常可能要比一些长的重复区域短。 在全基因组学公司的概念证明性的研究发表5个月后，第一个在外部运用全基因组学公司测序技术的研究就出现了。美国华盛顿州西雅图的一个小组研究了一家四口的遗传差异。在这一研究中，基因组测序被用于确定导致两种罕见孟德尔遗传病, Miller综合征和原发性纤毛运动障碍(primary ciliary dyskinesia)的四种候选基因。研究对象是一对父母和同时患有这两种病的两个孩子。这项研究突出地显示了家庭中全基因组测序在确定孟德尔性状时的优势。能确定传代模式大大地缩小了遗传搜索范围和提高了测序精度。对整个家庭测序，而不只是两个患病孩子的基因组，大大地减少了假阳性的候选基因数量，使之由34个缩小到仅仅4个。
仅仅一个月后，第二个在外部运用该测序技术的研究就由基因特克公司
（Genetech）的一个小组发表了。此项研究对一名有15年吸烟史的51岁高加索男性肺癌患者进行了分析，主要是比较原发性肺癌细胞和癌旁正常组织的基因组差别。他们发现了50000个单碱基突变，其中有530个是以前报道过的。通过全基因组分析对癌基因之外的大量单核苷酸突变和染色体结构变异的阐明，为充分理解原发性肺癌的发生机理和治疗带来了曙光。
第三个应用是来自达纳斯的德克萨斯大学西南医学中心一个研究小组，他们对一个患谷胆固醇症（高胆固醇血症）的11个月女孩进行了全基因组测序。该女孩经过系列的血液实验分析和选择性的基因测序，仍不能得到合理诊断。通过将其父母的基因组和一组对照基因组进行比较，发现了导致该谷胆固醇症的致病基因和相应突变。最后发现，是因为其大量的母乳喂养使该患儿血液中植物胆固醇水平低而导致标准血液检测失败。这一研究表明，复杂的环境因素会影响常规的标准检测，而全基因组测序对有效诊断具有重要意义。 边合成边测序法
边合成边测序思路的出现已经有些时日了，它是二代测序技术的基础，如454测序平台和Illumina测序系统都是建立在它的基础之上。这些方法与第一代测序技术比较增加了通量，然而光学成像系统需要检测每一个测序步骤。因为复杂的
光学系统将增加测序系统的成本，所以下一步要做的是寻找一种弃用光学系统的相对便宜的检测方法。
当这种想法出现时，斯坦福大学Pease 和Davis实验室的研究人员从早期的焦磷酸测序方法演变出一种检测微观结构中温度或pH值变化的新方法。因为这两种变化都是DNA合成过程中的副产品，这种方法摒弃了对发光进行检测。如同焦磷酸测序，这种热测序方法需要检测多个循环，在每个循环四种核苷酸中的一种掺入到系统中，然后通过检测温度变化来观察新掺入到DNA链中的核苷酸。每进行完一个循环，要彻底冲洗反应孔以去除残余的核苷酸，从而减少错误累积。这种创新性的检测方式导致了Genapsys公司从斯坦福基因组技术中心中建立出来。他们的热检测方法优于pH检测方法的地方在于，温度能通过降温块很快被重新复原，而氢离子必须要洗除干净。不过，作为生命技术公司新创分公司的Ion Torrent，运用pH变化来检测碱基掺入过程，在将新一代测序系统带入市场的道路上取得了重要进展。
Ion Torrent公司根据Ion Torrent公司的专利申请，场效应晶体管（Field-effect Transitors，FETs）被用来检测微池结构的pH变化（如图4）。为了增加通量，Ion Torrent测序芯片运用了高密度的微池阵列。每个微池就是一个单独的DNA聚合反应的小室，其中包含有一个DNA聚合酶分子和一个待测序片段。就在微池层的下面，是离子敏感层，紧接着是一个高密度的和微池一样排列的场效应晶体管阵列亚层。和焦磷酸测序类似，4种核苷酸的连续循环导入微池能保证原始序列分辨率，因为场效应晶体管能感受到核苷酸掺入时pH值的变化，并把这种信号转变为可记录的电压变化。因为电压的变化与每一步掺入的核苷酸数目有关，所以Ion Torrent测序芯片可对重复序列进行分辨。
图4. IonTorrent公司半导体测序芯片技术图示。A. 该芯片结构设计的逐层显示图。上层为单个的DNA聚合反应的微池，底部两层构成场效应晶体管离子传感器。每个微池有其相对应的场效应晶体管探头，以鉴别每一个pH值的变化。B. 侧面图：微池中，DNA聚合酶将两个重复的TTP核苷酸掺入测序片段中。反应过程中释放出的氢离子被下方的场效应晶体管检测到。
目前，Ion Torrent公司提供一次性使用的Ion 314测序芯片。明年他们计划投放第二和第三代芯片：Ion 316和Ion 318。Ion 314测序芯片上的120万个微池可产生大约10Mb的序列信息，且平均读长为100碱基。为
进一步增加通量，Ion 316和Ion 318芯片将分别设计620万和1110万个微池。Ion 318芯片将期望产出1Gb的测序数据，且平均读长为200碱基或更高。最终，Ion Torrent公司将追求测序\民主化\，将推出第一台价格合理（约5万美元），台式的和高通量的测序仪。
这种离子检测基础上的测序技术大有潜力来降低测序成本，但要测通整个基因组还存在缺陷。现在，短的读长严重限制了重组装过程和从头测序的组装，因为它还没有能力读通基因组长的重复区域。另外，由于这种测序方法的要一步步连贯的特性，如果反应步骤之间反应孔没有清洗干净，错误累积就会发生。最后，和前一代焦磷酸测序方法一样，要测通长达5-10碱基的由同一种核苷酸形成的小重复序列（同聚体区域）仍将是一个挑战。Ion Torrent公司已报道关于测序准确性的数据，这些数据是关于大肠杆菌DH10B样品的测序，其中对同聚体进行了分析。对5聚的同聚体进行测序的准确度为97.5%。然而，难以了解到得出这一准确度的样品总数，且他们对于超过5个碱基的同聚体测序的准确度的数据也没有进行报道。 纳米孔测序技术
一种基于纳米孔（纳米洞）结构的完全不同的测序技术，由Branton和Bayley在以前的综述中描述过。单个碱基的读取可以靠测定经由纳米级别的孔洞而跨越或透过薄膜的电导率来进行。纳米孔是比双链DNA分子略宽的空洞，宽度为4nm， DNA分子像一条线一样穿过纳米孔。理论上来说，每种碱基的化学性质差异会导致流经该纳米孔的电流值发生变化。纳米孔也可以设计成检测跨越空洞的隧道电流，因为每种碱基的电势不一样，这样就可以分辨出各种碱基。还在发展中的纳米孔测序方法是很有潜力的第四代技术。因为这种方法不再需要光学检测和同步的试剂洗脱过程了，所以它得到了\第四代\的雅号。
纳米孔技术可以广泛地归纳为两类：生物类和固态类。α溶血素是一种能天然性地连接到细胞膜中继而导致细胞溶解的蛋白质，它第一个被用来做成生物纳米孔模型。模型中，一层生物膜将溶液分为两个区域，α溶血素蛋白嵌入生物膜中形成纳米孔。当DNA分子穿过纳米孔时阻断电流会发生变化，这时灵敏电子元件就能检测电流的变化。但是，由于四种碱基的理化性质比较接近，所以读取序列实际上比想象的困难得多。此外，有效减少电子噪音仍旧是个挑战，通过降低DNA的位移速率可以部分减少噪音。最近，牛津纳米孔与许多团队在解决这些问题上取得了一些进步。
第二类纳米孔是以硅及其衍生物进行机械制造而成。使用这些合成的纳米孔可以降低在膜稳定性和蛋白定位等方面的麻烦，而这些正是牛津纳米孔公司所创立的生物纳米孔系统一直遇到的问题。例如，Nabsys就发明了一套系统，他们以汇聚的离子束将硅片薄膜打成纳米孔，用于检测与特异性引物进行了杂交的单链DNA穿过纳米孔时的阻断电流变化。 IBM创建了一个更为复杂的系统，能有效地使DNA位移暂停，并在暂停的时候通过隧道电流检测识别每个碱基。这两种纳米孔技术将随后进行详细介绍。
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