课题3 血红蛋白的提取和分离
【课题目标】
本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。 【课题重点与难点】
课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。
课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
【导学诱思】
思考1：分离生物大分子的基本思路是什么？ 思考2：蛋白质的分离和提取的原理是什么？
思考3： 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？ 思考4：人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
一、基础知识：
㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）：
1、概念：根据被分离蛋白质的 ，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来分离蛋白质的有效方法。
2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对 的蛋白质容易
进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ，而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 3、具体过程：
（1） （2） （3） （4） （5
）
相对分子质
量较小的蛋 粒凝胶
颗
相对分子质 多量较大的蛋孔
板
A A. 的蛋白质由
B 于 作用进入凝
胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。
B.（1） 混合物上柱；
（2）洗脱开始， 的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内； 的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；
（3） 的蛋白质被滞留； 的蛋白质被向下移动。 （4） 不同的蛋白质分子完全分开；
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（5） 的蛋白质行程较短，已从 中洗脱出来， 的蛋白质还在行进中。
㈡ 缓冲溶液：
1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
2、作用：能够抵制 的对溶液的 的影响，维持PH基本不变。
3、缓冲溶液的配制
通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 就可以制
得 使用的缓冲液。 思考：说出人体血液中缓冲对？ 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？
使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）
㈢电泳：
1、概念：指 发生迁移的过程。
2、原理：许多重要的生物大分子，如 等都具有 在 下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本
身 、 的不同使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。 3、分类：
带电性质、分子大小和形① 电泳 加入待分离状的不同，使分子迁移速② 电泳。 的样品 度不同
测定（ 蛋白质相对分子质量 ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）阴 阳极
极 —聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多 少以及分子的大小等因素。 溶 液为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加
琼入 。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组槽脂成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测
胶定的结果只是 。SDS能与各分子向阳极移动 缓冲液 种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超凝胶电泳原理示意图 过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电
荷差别，使电泳迁移率完全取决于 。
二 实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定 1.样品处理
(1)红细胞的洗涤
①目的：去除
②方法： 离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层 的红细胞液体倒入
再加入用 的 质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤 ⑤低速离心（低速短时间）
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⑥重复4、5步骤 次，直至上清液中已没有 ，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。 (2)血红蛋白的释放
加 到 体积，再加40％体积的 溶解细胞膜） ，置于 上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白.
(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层:
第1层（最上层）： 甲苯层
第2层（中上层）： 的沉淀层， 色薄层固体 第3层（中下层）： 的水溶液层， 的液体 第4层（最下层）：其它杂质 的沉淀层 (4)透析
2.凝胶色谱制作
1）凝胶色谱柱的制作
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
②底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；
b、在橡皮塞顶部切出锅底状的 ，在0.5ml的 头部切下 长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。
c.剪尼龙网小圆片覆盖在 上，用 的尼龙纱将橡皮塞 包好，插到玻璃管一端。
d、色谱柱下端用移液头部做 ，连接一细的 ，并用螺旋夹控制尼龙管的 ，另一端放入收集 的收集器内 ③顶塞的制作：
插入安装了玻璃管的橡皮塞
④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 ⑤安装其他附属结构。 2）凝胶色谱柱填料的处理
（1）凝胶的选择： 。 （2）方法：
配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀后，配成 。
（3）凝胶色谱柱的装填方法
① 固定：将色谱柱处置固定在支架上
②装填：将 一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 ③洗涤平衡
装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在 高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分 12小时。 3）样品加入与洗脱
（1）加样前：打开下端出口，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐，关闭出口 （2）加透析样品
①调整缓冲液面：与凝胶面平齐
②滴加透析样品：用 将1ml 的样品加到色谱柱的 ③样品渗入凝胶床： ④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱
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