腺病毒载体操作手册
腺病毒载体操作手册
一、实验流程
制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质
粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料
（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。pHBAd-CMV-IRES-RFP和 pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
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1、载体信息
1) 腺病毒克隆载体图谱如下： ITRITR1NdeI( )SacIIXbaI(456)( )NotIAgeI(731)pU6EcoRI(742)BamHI(748) ITRAmpr( )NotI( )NcoI( )NcoISacIIXbaI(456)ITR1NdeI( )( )NdeINheI(1384)( )NotIAgeI(731)( )EcoRI(742)BamHI(748)NsiIpU6 Amp Amprr( )NdeINheI(1384)pHBAd-U6-GFP5118bpPCMVNsiIPCMVNotI( )pHBAd-U6-RFP4993bpRFP( )AgeIHindIIISacI SaII GFPpUC oriLoxPSV40 PolyA[HindIIISacISalIpUC oriLoxPSV40 PolyA PacI ITR ITR1ITRITR1pMCMVEcoRI(1042)pMCMVAmprpHBAd-MCMV-IRES-EGFP5322bp pUC ori PCMVpHBAd-MCMV-RFP5337bpNdeINcoINheIPstIBamHISmaIEcoRIBglIINotINsiIIRESEGFPAgeIClaIRFPpUC oriLoxPSV40 PolyAAgeIClaI LoxPSV40 PolyA 各载体用途如下表：
干扰 过表达 标记示踪
腺病毒载体名称 pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP pHBAd-CMV-IRES-GFP, pHBAd-CMV-IRES-RFP pHBAd-CMV-IRES-GFP, 2
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pHBAd-CMV-IRES-RFP, pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP
2） 骨架质粒信息如下：
2、细胞株 293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株 大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养
（一） 293A细胞的冻存
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293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；
2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板 中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大格均计 数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即 为实际 n万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。
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