RT-PCR实验步骤
一．实验器具：
1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl 2.吸头：1ml、200μl、20μl 3.匀浆管：5ml
4.EP管：1.5ml、500μl、200μl
5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放75%乙醇) 6.量筒：100ml 7.容量瓶：1000ml
8.试管架：5ml、1.5ml、20μl 9.铝制饭盒：1-2个 10.大瓷缸：1个 11.锡泊纸：一卷 12.卷纸：2卷
13.三角烧瓶：带盖，稍大
二．实验器具处理
1.塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入DEPC水)，过夜后取出(注意：DEPC水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的DEPC物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干)。高压后烤干备用。如果DEPC处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。
2.玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，先泡1‰DEPC过夜，再蒙锡纸烤干备用。 3.匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，超声消毒即可(不需要泡DEPC)。
三．试剂配制
1．DEPC水：吸出1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。
2．75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(DEPC水需先高压，高压时注意：1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适当多加一点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。
3．异丙醇：放入棕色瓶中。 4．氯仿：放入棕色瓶中。 5．琼脂糖
四．缓冲液配制
1．电泳缓冲液(5×TBE贮存液)：Tris 54g、硼酸 27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加蒸溜水至1000ml。使用时，将5×TBE稀释10倍成0.5×TBE就可以在电泳时使用(工作浓度)
2．上样缓冲液(6×缓冲液，4℃保存)：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油
五．琼脂糖凝胶配制
1．1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶，一定要煮透，
以不出现泡沫为标志)，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快琼脂糖凝固)后现进行电泳。
2．1.5%:同上，将琼脂糖的量改为1.5g
六．需购置材料
Taq酶(-20度保存)(配10×buffer和MgCl2)：不需要使用高保真Taq酶，一般的就行。个人感觉天为时代的普通Taq酶就很不错。
dNTP(4度保存)：向生物公司购买，原装和分装均可。
oligo(dT)15(-20度保存)：可以向生物公司购买Invitrogen合成的廉价货，每支10元，稀释后使用(注意稀释浓度)，也可以购买Promega的原装货，稀释10倍后使用，稀释液4度保存。
M-MLV(-20度保存)：向生物公司购买，推荐使用Promega的，当然有钱可以购买更好的AMV。 RNasin(-20度保存)：向生物公司购买，推荐使用Promega的，原装分装均可。 DEPC(4度保存)：向生物公司购买，5克足矣。
Trizol(4度保存)：有50ml和100ml规格，按照实验需要自己购买。国外进口的有Invitrogen(Trizol)、罗氏(Tri Pure)、MRC(Tri Reagent)；国内的也行，天为时代的就不错。
Marker(4度保存)：按照目的条带大小购买，推荐使用天为时代的Marker(物美价廉，上样2.5ul就很亮了，较3.0ul的Takara同样品种Marker为亮)，本人很喜欢它的DL2000。
电泳Loading Buffer(4度保存)：按照配方自己配制，不需要购买(购买的话价格挺贵)。
七．引物合成
1．内参照：GAPDH(452bp) 正义：5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 反义：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3
2．退火温度计算：2(A+T)+4(G+C)，正反义平均数，再上下波动4-5度。 3．引物2 OD已足够，每管1 OD分装。
4．引物稀释：加DEPC水量(μl)＝ X nmol/OD(合成的引物管上有标注) × 管上所标OD数(推荐每管引物为1 OD分装，合成之前向公司说明这一点，切记！！)×100。最终引物浓度为10pmol /μl。
八．PCR产物电泳
取1-10μl(一般取5μl)PCR产物，加已点在纸上的6×上样缓冲液，反复吸打混匀后进行电泳，一般用稳压状态进行电泳，100V左右，电泳20-30分钟，紫外灯下观察，结果进行扫描保存。
九．注意点：1 逆转录后应立即冰水浴 2 RNA抽提前，打开离心机预冷
TRIzol法抽提总RNA
组织100mg/细胞1×107
↓
加1mlTRIzol
↓
组织：匀浆(彻底，分几次打，是匀浆时产生的热量能散出，后转至EP管)
细胞：用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
试剂 M-MLV Buffer dNTP RNasin M-MLV 浓度 5× 10mM 40U/μl 200U/μl 体积 4μl 1μl 0.5μl 1μl 终浓度1× 0.5mM 加氯20μ 仿1/5200U 体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
4℃，离心12000g，15分钟
↓
转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中
↓
加等体积异丙醇(约400μl)，混匀室温10分钟
↓
4℃，离心12000g，10分钟
↓ 弃上清 ↓
加冰预冷的75%乙醇(DEPC水配)1ml
↓
4℃离心7500g，5分钟
↓
弃上清，空气干燥5-10分钟(不能完全干燥)
↓
溶于DEPC水中
注意：1.RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解。
2.细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60℃放置至少一个月(甚至可一年以上)。 3.RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年。 4.弃上清的操作，我们一般将EP管倒置在平铺于桌面的卷纸上，吸干。
5.最后一步弃酒精，将RNA溶于DEPC水的操作，我们的做法是：先按4的步骤吸干酒精，其实这样还是不彻底的，再将EP管小离心后用20μl小枪头(DEPC处理过的)吸出多余的酒精。最后用200μl中枪头(DEPC处理过的)吸11.5μl(20μl体系，如果是40μl体系则加倍)的DEPC水至EP管中，吹打助溶，然后转移至200μl的EP管(这些EP管中可以事先加好Oligo(dT)15，以节省枪头)中。
两步法RT-PCR
(第一步：逆转录反应：20μl体系，如果是40μl体系则加倍)
试剂 浓度 体积 终浓度 RNA 11.5μl Oligo(dT)15 0.05μg/μl 2μl 0.005μg/μl (0.05μg/μl Oligo(dT)15为Oligo(dT)15原液稀释10倍的浓度)
↓
混匀，离心，70℃ 5min
↓
立即冰水浴，稍离心
↓
总体积20μl
↓
混匀，离心，42℃ 60min
↓
95℃ 10min(破坏M-MLV)
↓ 4℃保存
(第二步：PCR反应：总体积20μl，如果50μl体系，相应加倍)
↓ 混匀 ↓
(28-36循环，4℃保存)
试剂 Taq Buffer MgCl2 dNTP 上游引物 下游引物 cDNA模板 DEPC水 Taq酶 意：1.Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20℃保存，操作时置于冰上。 2.dNTP保存在4度即可，勿反复冻融。
3.如果一次做很多管，可以先将共同需要的部分一起加(稍微多算一点，例如20管分装，可以加入
21-22管的量，因
95℃ 5分 预变性 为枪头会吸附一94℃ 30秒 变性 定的液体，可能X℃ 30-40秒 退火 有人认为这样会72℃ 30秒 延伸 浪费试剂，其实72℃ 7分 终末延伸 不然，因为每管分开加的话试剂用量更多，枪头吸附的试剂的量其实也是很可观的，特别是国产的枪头，这样做同时还能降低加样误差)，然后各管分装，再加各自不同的部分。
4.如果200μl的EP管在PCR过程中盖子容易炸开，解决方法有：(1)用封口膜将管口密封、(2)最后每管加入液体石蜡进行液封。
浓度 10× 25mM 10mM 10pmol/μl 10pmol/μl 2.5U/μl 体积 2μl 1.2μl 0.2μl 0.4μl 0.4μl 1μl 14.7μl 0.1μl 注终浓度 1× 1.5mM
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