物与模板DNA退火以后，在DNA磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放欧联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列目的，反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成，反应底物为5?—磷酰硫酸和荧光素。
SOLiD sequencing（SOLiD测序):它是通过寡核苷酸连接和检测来进行测序的方法。 SOLiD法测序的原理是：SOLiD技术采用四色荧光标记寡核苷酸进行连续连接合成代替聚合酶链接反应为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，可对单拷贝DNA片断进行大规模扩增和高通量并行测序。这种替代能够明显减少因碱基错配而出现的错误，消除相位不同步的问题，以获得更高的保真度。另外，SOLiD系统采用末端配对分析和双碱基编码技术，在测序过程中对每个碱基判读两遍，从而减少原始数据错误，以提供内在的校对功能，它是目前新一代基因分析技术中准确度最高的。SOLiD的特点在于其无可比拟的高通量、可扩展性、精确性、方便性和运用灵活性
顺式作用元件(cis-acting element) 反式作用因子(trans-acting fator子
（1）Cairns模型(Cairns model)：即θ模型，是环状双链DNA的一种复制模型。 细菌.环状DNA分子双向复制原则,复制点形成一个复制“泡”，泡逐渐扩大，形成像希腊字母“θ”的形状,最后由一个DNA环复制为两个子环。
（2）滚环模型(rolling-circle model)：即σ模型，是环状单链DNA的一种复制模型。 病毒，在复制时由对正链复制原点处进行单链特异性切割，所形成的5?端即从双股DNA置换出来，并为SSB所覆盖，这时的DNA聚合酶III以3?－OH为引物，以负链为模板，从3?－OH基端逐步增添脱氧核苷酸，随着复制的进行，5?端长度即不断增加，这一过程中，单链尾巴的延伸伴随着双链DNA的绕轴转动，故称为滚环式复制。 真核rDNA的扩增、F因子DNA的转移、λ裂解途经的复制以及 φX174、M13、G4等环状单链DNA噬菌体的第二阶段复制都是进行滚环复制的。 滚环复制又叫σ复制，有以下特点：
①共价延伸。 ②模板链和新合成的链分开。③不需RNA引物，在正链3?－OH上延伸； ④只有一个复制叉；
⑤形成多联体（concatemer）
（3）D环模型(D-Loop model)：是线粒体、叶绿体DNA 线粒体DNA的双股链由于浮力密度的不同而分为轻链（L链）和重链（H链），它有两个单向复制叉，两条链的复制原点不在同一点上，而且两个复制原点的激活有先有后，复制从H链的原点开始，以L链为模板，新合成的H 链即转换为原来的 H链，所形成的结构为取代环，或D-环，故称D环复制。D环复制又叫σ复制，有以下特点： (1)mtDNA的每条链有1个独立的复制起始点序列； (2)H链在D环中启动复制； (3)当第一个fork移动使L链的起始点暴露时，L链启动复制； (4)叶绿体DNA采用相同的复制机制； (5)mtDNA 的复制是随机的； (6)线粒体通过增加与其数量呈比例的基因组数目来完成其DNA复制； (7)不同mtDNA复制次数可能不同，这可能导致子代线粒体中等位基因的表现度改变； (8)线粒体分离到子细胞中也是随机的。
DNA Polymerase I：结构、功能
大肠杆菌DNA聚合酶I是一种依赖于DNA的DNA聚合酶，分子量109kd。它有5′→3′DNA聚合酶活性，5′→3′及3′→5′外切酶活性。
有6个结合位点： 1）模板DNA结合位点； 2）DNA生长链或引物结合位点； 3）引物末端结合位点，用以专一引物或DNA生长链的3'-OH； 4）脱氧核苷三磷酸结合位点； 5）5'→3'外切酶活性位点，用以结合生长链前方的5'-端脱氧核苷酸并切除之； 6）3'→5'外切酶活性位点，用以结合和切除生长链上未配对的3'-端核苷酸。
DNA聚合酶I的功能： 5?→3?①的聚合作用。 5?→3?②外切酶活性。 3?→5?③的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸——切口平移（nick translation）；链的置换及模板转换（template-switching）等。
DNA甲基化：形式、意义、检测方法
DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下,在基因组CPG二核苷酸的胞嘧啶5?碳位共价键结合一个甲基基因。
主要形式：5－甲基胞嘧啶（5-mC）、少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌呤（7-mG）。意义：能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。 DNA甲基化的检测方法：
（1）重亚硫酸盐(亚硫酸氢盐)修饰（2）用甲基化特异性引物对进行PCR扩增
RNA聚合酶（RNA polymerase简称RNAP）或称核糖核酸聚合酶，是一种负责以DNA或RNA为模板催化RNA合成的酶。主要指DNA指导的RNA聚合酶，即以DNA为模板，以4种核苷三磷酸（ATP，GTP，CTP和UTP）为底物，从5′到3′合成RNA的酶。其催化方式与DNA聚合酶相似，但不具备有校正作用的外切核酸酶活性，聚合反应也不需引物。
（1）RNA 聚合酶的结构：
全酶(α2ββ'σ)：能同启动子部位结合，并催化转录的起始。 核心酶(α2ββ')：催化RNA 的（延长）合成。 （2）亚基的功能：
α亚基可能与识别启动子区域的顺序有关。
β亚基是RNA 聚合酶的催化亚基，可与RNA 聚合酶抑制剂结合，从而导致酶活性的丧失。
β'亚基的功能与RNA 聚合酶同模板DNA 的结合有关。用酶解的方法将β'亚基除去，导致该酶同DNA结合能力下降。
σ亚基（因子）与RNA 聚合酶对启动子部位的识别有关。一旦RNA 聚合酶结合在正确的转录起始部位上，且合成第一个磷酸二酯键后，σ因子便解离出来。不同的σ因子识别不同的启动子，基因的表达受不同的启动子控制。 真核生物RNA聚合酶的分类、核定位、转录产物
分类：真核生物的RNA聚合酶主要有三种，即RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ。
核仁，负责rRNA基因的转录生成除5SrRNA外的各种核蛋白体RNA（rRNA）,核质，负责转录产生mRNA前体，即核不均一RNA-hnRNA，需要“TATA”框。 胞质，负责tRNA基因如tRNA、5SrRNA和snRNA
Sigma（σ）因子：是原核生物RNA聚合酶全酶的成份。Sigma因子本身并无催化功能，
但是它对在正确启动子位点起始转录是必要的. sigma因子决定RNA聚合酶识别特异性，Rho因子：是原核生物转录终止因子，有ATP酶和解螺旋酶两种活性。 原核生物启动子
由两段彼此分开且高度保守的核苷酸序列组成。
启动子区域包括： （1）Pribnow盒：位于转录起始位点上游5-10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T，故又称为TATA盒或-10区。（2）-35区：位于转录起始位点上游35bp处，一般由10个碱基组成。原核细胞不能识别真核基因的启动子。为了表达真核基因，必须将其克隆在原核启动子的下游，才在原核表达系统中被转录。在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的强启动子有lac、trp、PL和PR以及tac
真核生物启动子： 真核基因启动子是由基因转录起始位点（+ 1）及其5?上游近端大约100~200bp以内（或下游100bp）的一组具有独立功能的DNA序列组成。
启动子区域包括： A、核心启动子：包括转录起始位点（+1）（一般是A或G）及转录起始位点上游-25/-30bp处富含TA的典型元件TATA框。它是使RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列。 B、上游启动子元件：包括通常-70bp附近的CAAT框（GGCCAATCT）和GC框（GGGCGG）等，能通过TFⅡ-D复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。
转录起始位点 转录起始位点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应的DNA链上的碱基，研究表明常为一个嘌呤（A 或Ｇ）。 寻找并确定起始位点的方法：
（1）引物延伸分析（primer extension analysis）
引物延伸分析用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端，确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域，随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5`末端间的碱基数，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。
（2）核酸酶S1作图（Mapping RNA with Nuclease S1）
三种不同的核酸酶——S1核酸酶、RNA酶、外切核酸酶VII被用来进行RNA定量，确定内含子位置，及鉴定在克隆的DNA模板上mRNA的5`-末端和3`-末端的位置。含有目的mRNA的RNA样品与互补的DNA或RNA探针在利于形成杂合体的条件下温育。在反应的末期，用核酸酶来降解未杂合的单链RNA和DNA，余下的DNA-RNA或RNA-RNA杂合体用凝胶电泳分离，接着用自显影或Southern杂交来观察。当探针的摩尔数在杂交反应中过量时，信号强度与样品中目的mRNA的浓度成正比。用过量探针与一系列定量的靶序列杂交作出标准曲线，从而可准确估算样品的浓度。在真核系统中，S1核酸酶消化过的5`-末端通常代表转录起始点，而3`-末端代表聚腺苷酸化的位点。同样的策略可用来对拼接位点的5`-末端和3`-末端作图。
请设计一个实验证明某基因存在一个内含子 ？
内含子的鉴定是通过所谓的“berk-sharp“制图法又称S1核酸制图法来实现的，其原理是：利用s1核酸酶的单链特异性，核酸酶Ⅶ的单链外切特异性，以及稀碱溶液能分解
RNA的特性，来对杂交分子做不同的处理以得到外显子的长度。内含子的长度以及基因的总长度。
首先将DNA进行转录—mRNA--进行杂交，一份杂交分子用S1酶处理，降解单链区，有缺口的DNA与mRNA杂交双链分子，走电泳得到一个带，外显子连接起来的长度;碱溶液，走电泳，多条带，外显子带。另外一份用外切核酸酶Ⅶ处理，去除两端没杂交的DNA，在用碱溶液处理，去除RNA，走电泳得一条带为外显子及内含子的总长度。鉴定内含子。
RNA转录后加工的机制：
（1）原核生物中RNA的加工 mRNA一般不进行转录后加工，一经转录通常立即进行翻译。 rRNA的基因与某些tRNA基因组成混合操纵子，转录后需切割，断链成为rRNA和tRNA，大肠杆菌rRNA：rRNA前体先经甲基化修饰，再被切割。 tRNA：由内切酶在tRNA两端切断；3?端切去附加顺序，进行修剪；3?端加上-CCA-OH；核苷酸修饰和异构化，ψ和T由U修饰而来。
（2）真核生物中RNA的加工 大多数真核基因都是断裂基因，转录产物需通过拼接，去除插入部分（即内含子），使编码区（外显子）成为连续序列。RNA编码序列改变称为编辑，RNA编码和读码方式的改变称为再编码。由于存在选择性拼接、编辑和再编码，一个基因可以产生多种蛋白质。
真核生物mRNA前体的加工：必须经复杂过程，还有5?端加帽子，3?端加polyA。 rRNA和tRNA的加工：也需剪接、编辑、内部甲基化、修饰异物化、戴帽和加尾。
逆转录酶（reverse transcriptase）又称RNA指导下的DNA聚合酶、 RNA合成酶、RNA复制酶，它是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。 逆转录酶的结构
（1）哺乳类C型病毒的反转录酶和鼠类B型病毒的反转录酶都是一条多肽链。 （2）鸟类RNA病毒的反转录酶由两个结构相关的亚单位组成。 （3）真核生物中的反转录酶则结构多样。 逆转录酶的功能
以dNTP为底物，以RNA为模板，以tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3'-OH末端上，按5'→3'方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA，它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后在逆转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。 逆转录酶是多功能酶，有3种酶活力：
（1）形成杂合分子RNA-DNA，为RNA指导下DNA聚合活力。 （2）形成双链DNA，为DNA指导下的DNA聚合活力。
（3）水解RNA-DNA杂合分子中的RNA，为核酸外切酶活力。
逆转录酶无校正功能，因此错误率较高。（逆转录酶只对病毒本身的RNA起作用。） 逆转录酶的应用
（1）可作为合成某些特定RNA的互补DNA的工具酶。 （2）可用于DNA的序列分析和克隆重组DNA。
反转录酶已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从
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