Leica TCS SP2 激光共聚焦显微镜系统操作手册
一、荧光显微镜Leica DMRE的使用
A：步距调节 B：电动升台按钮 C：电动降台按钮 D：微调 E：上限设置 F：下限设置
1、观察、扫描转换拉杆 2、卤素灯开关
3、透射光探测器开光横档 4、荧光光路开关
5、荧光滤镜转盘1：DAPI；2：TRITC；3：FITC；4：SCAN 6、镜头侧DIC棱镜转盘 7、与镜头相配DIC滤块 8、起偏器 9、检偏器
10、镜头侧DIC棱镜微调旋钮 11、光强调节纽 12、减光滤光片 13、孔径光阑 14、视场光阑
选择合适的镜头
Leica TCS SP2 镜头配置
镜头类型 使用介质 放大倍率/数值孔径 编号 HC PL APO CS DRY 10X /0.4 506511 HC PL APO CS DRY 20X/ 0.7 506513 HC PL APO CS DRY 40 X 0.85/ CORR 506140 HC PL APO Ibd.BC OIL 63X /1.4 506192
Leica TCS SP2 AOBS 镜头配置
镜头类型 使用介质 放大倍率/数值孔径 编号 HC PL FLUOTAR DRY 10X/0.3 506505 HC PL FLUOTAR DRY 20X/0.5 506503 HCX PL APO OIL 40X/1.25-0.75 506176 HC PL APO Ibd.BC OIL 63X/1.4 506192 HCX PL APO CS OIL 100X/1.40-0.70 506038 WATER HCX APO L U-V-I WATER 63X/0.9 506148
荧光观察
荧光光路开关至“O”位， 转轮至“1.0×”位， 转换拉杆完全推进，
荧光滤块换到相应号位（1：DAPI；2：TRITC；3：FITC；4：SCAN）
图像输出扫描
荧光光路开关至“I”位， 转轮至“UV”位， 转换拉杆完全拉出，
荧光滤块换到4：SCAN）
荧光观察（以油镜观察为例）
1、 样品正面朝上正确放在显微镜样品台上，点上镜油。
2、 长按电动升台按钮，使镜头和样品上镜油接触，调节微调旋钮，找到样品。 3、 将光路转换成荧光观察位置，找到预扫描目标，将光路转换至扫描状态。
二、Leica LCS 软件的使用 （一）、Leica confocal software 界面
软件面板介绍 左：
TCS-menu：accquire view 3D process quantify application 右：
image windows
（二）、设置参数
打开软件，默认在Acquire面板中，mode扫描模式为xyz，Format扫描像素为512x512，average line/frame average 为1。
Mode 扫描模式： 空间扫描模式：xyz xzy 时间扫描模式：xt xyt xzt xyzt 光谱扫描模式：xyλ xzλ
Format扫描像素一般设置为1024 x1024。
average line一般设为4或8。
（三）、软件具体的操作使用 单荧光道扫描 多荧光扫描 DIC图像扫描
荧光与DIC图像同时扫描 多层扫描 时间序列扫描 光谱扫描 ROI扫描 FRET FRAP
LIVE MODE 多方法组合 荧光强度分析
单荧光扫描
1、按Acquire 按钮中的Beam键打开光路设置对话框窗口 2、点击Mode选择扫描模式，如平面扫面 xyz
3、点击Format选择扫描像素，一般用 512x512或1024x1024
4、点击Average line / frame average 选择获取图像时平均的次数： 4-8次 5、双击相应荧光素或染料方法，如FITC、TRITC等 6、点击continuous，优化图像质量
用快捷钮Z Position调节到最佳层面，点击 Q LUT 使图像颜色变为伪彩Glow O&U 模式（观察样品荧光强度），用相应PMT调节荧光亮度，Zoom调节电子放大倍率。
点击Stop
点击Beam path 中的save键，保存个人的扫描方法 7、点击single键扫描获取图像 8、save 保存图像到硬盘上。
多荧光标记
1、按Acquire 按钮中的Beam键打开光路设置对话框窗口 2、点击Mode选择扫描模式 xyz
3、点击Format选择扫描像素 512x512或1024x1024
4、点击Average line / frame average 选择获取图像时平均的次数 5、双击相应荧光素或染料方法，如FITC 6、点击continuous，优化图像质量
点击 Q LUT 使图像颜色变为伪彩Glow O&U 模式，用快捷钮Z Position调节到最佳层面，用相应PMT调节荧光亮度，Zoom调节电子放大倍率。 Stop
点击Beam path 中的save键，保存个人的扫描方法 其他荧光同样操作后
7、点击Beam path 中Sequential Scan，将个人的多种荧光扫描方法添加到面板中，选择between frames。
between lines 各个通道一线一线分先后扫描 几乎同时成像 between frames 各个通道分先后扫描 先后成像 （多用此法）
between stacks 多层扫描中，先扫完一个通道的多层，再扫另一个通道的多层 8、点击series 键扫描图像
9、点击overlay获取叠加图像，选中叠加图片，单击右键send to ---- experiment ----
selection（raw） （保存选中的图片的原始格式，扫描像素一定，固定大小，单通道图片可以在leica软件中再编辑，overlay图片不能再编辑） selection（snapshot）（保存选中的图片的抓图模式，显示大小） All Snapshot （保存抓图模式，整个窗口） 9、save 保存图像到硬盘上。
DIC图像扫描
1、将显微镜DIC棱镜调整至与观察用镜头倍数相配，如镜头为63x，DIC棱镜就调到40/60的位置
2、镜头侧棱镜由BF调整到与观察用镜头型号相配，如镜头标示为∞/0.17/D，棱镜就调到D 3、双击Beam path 面板方法中的Transmission 4、点击continuous，优化图像质量 用快捷钮Z Position调节到最佳层面，
打开signal面板，用signal面板中Tr PMT Gain调节图像亮度，Tr offset 调节图像对比度（值不宜过小），Zoom调节电子放大倍率。
点击Beam path 中的save键，保存个人的DIC扫描方法 5、点击single键扫描获取图像
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