生化实验报告 - 图文

生化实验报告

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实验1.多酚氧化酶（PPO）的分离提取

一、实验原理与目的

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。但是PPO的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一，影响一些经济植物产品的质量。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。

本实验将采用马铃薯为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。 二、实验材料与试剂

1.材料：马铃薯（大约每小组100-200g）

2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH6.（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）配制时配×10倍的浓缩液1000ml； 固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）配制时配×10倍浓缩液100ml；0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）配制时配×10倍浓缩液1000ml； NaCl； 聚乙二醇： DEAE－纤维素 DE52； 葡聚糖凝胶Sephadex G-200: 三、 实验步骤 （1）粗酶提取： 马铃薯丁按1:1（W/V）比例与0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆后4层纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。

（2）盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液再加入固体硫酸铵达到70％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清液，收集粗酶沉淀；沉淀用0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）溶解，装入透析袋中用0.02M KCl溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。 四、实验结果

1.实验所得的初提酶液颜色为米黄色，较其他组的颜色浅。主要是本组实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少；从而最大程度的保留了PPO的活性。

2.经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体。为进一步的柱层析提供了优良材料。 五、讨论与结论

1.本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化。 2.离心管的内盖一定要盖严，否则在离心过程中会洒出来对离心机造成损害，离心之前一定要仔细检查盖子是否合适。

3．加入硫酸铵固体时一定要注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果。

实验2 胰酶的分离提取

一、原理与目的

提取制备胰酶的经典方法，多采用硫酸胺分级沉淀，胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在10%硫酸胺饱和度下被沉淀而除去。经多次提取，最后在PH8.0硼酸缓冲液中得到结晶。胰酶在PH3.0时最为稳定，可在低温下储存较长时间而不失活；低于此PH酶易变性；高于PH5.0时，酶易自溶而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程易在低PH和低温下进行。

本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。 二、材料与试剂

1.材料：新鲜猪胰脏

2.试剂：PH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2MNaOH溶液、5MNaOH溶液、0.1MHCl溶液、0.025M HCl溶液、0.01M HCl溶液、0.4M PH9.0硼酸缓冲液。 三、操作步骤

称取1-1.5Kg新鲜猪胰脏，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，粉碎胰脏。 加100m巳预冷却的pH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取， 检查提取液中PH，若高于pH3.0时应及时用10％乙酸调节，使提取液维持在PH2.5-3.0之间，在冷室5℃左右搅拌提取18—24h，4层纱布过滤，取滤液50m1pH2.5乙酸酸化水抽提残渣一次(时间约为1一2h) 合并滤液，用5MH2PO4溶液调正pH至2.5-3.0。 放置3—5h后，，取上清，量其总体积。

盐析：加固体粉状硫酸铵，至40％饱和度盐析1hr， 12000rpm 离心 10min。上清液加硫酸铵，至75％饱和度 盐析1hr， 12000rpm 离心 10min。沉淀 溶于10ml pH7.5, 0.1 MTris，透析过夜，4 ℃保存。 四、结果与分析

1. 经过以上实验步骤得到澄清的酶液。

2. 用新鲜的猪胰脏是因为新鲜的胰脏胰酶含量高，容易分离提取。

3. 提取过程中保持pH值2.5-3.0之间，胰酶在PH3.0时最为稳定，可在低温下储存较长时间而不失活；低于此PH酶易变性；高于PH5.0时，酶易自溶而失活。

实验3 卵清蛋白的分离提取

一、实验原理

鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定。

由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白作亲和配基制备纯化胰酶的亲和柱材。 二、实验材料与试剂 1.材料：新鲜鸡蛋2只

2.试剂：10％ TCA（用固体NaOH调pH至1.05～1.10，需要50 ml。）；5 N HCL；5 N NaOH；冷丙酮；胰蛋白酶液；BAEE－0.05 M；pH 8.0 Tris－HCL缓冲液（每ml含0.34BAEE和2.22 mg CaCl2，50 ml。）；pH 8.0，0.1 M Tris－HCL缓冲液。 三、操作步骤

（1）新鲜鸡蛋两只，取蛋清50 ml，温水浴25℃～30℃，加入等体积的三氯乙酸－丙酮（1:2V/V），最终pH约3.5。再继续搅拌30 min，4℃放置过夜 。 （2）次日用布氏漏斗抽滤（或离心），得黄绿色清液。加入4℃预冷的丙酮200 ml，在4℃放置2 h之后，弃上部丙酮液，下部沉淀部分于10000 rpm离心5 min，收集沉淀。沉淀溶于10 ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4 h，换水两次，再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜。10000 rpm离心10 min,取上清液，再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜。

（3）第三天，10000 rpm离心10 min,取上清液。 四、实验结果与分析

1.经过以上实验步骤得到了较为纯净的鸡卵粘蛋白，呈白色粉末状。

2.在实验中要控制pH值，不能使其成碱性，否则粘蛋白会分解，影响粘蛋白的量。

3.在离心以后一定要弄清楚是收集沉淀还是上清液，否则实验将会失败。 4.透析后若袋中有沉淀，则要再次离心出去沉淀。