实验4 柱层析纯化PPO
一、实验原理
柱层析技术是常用的纯化酶、蛋白的手段。在普通生化操作中经常通过离子交换层析和凝胶层析联用实现蛋白质的纯化。
（一）离子交换层析：离子交换剂是一种不溶性高分子化合物，分子中含有可解离的基团，在水溶液中能与溶液中的其他阳离子或阴离子其交换作用。当一定量的溶液通过交换柱时，溶液中的离子不断被交换而浓度逐渐减少，全部被交换并吸附在树脂上。交换反应都是平衡反应，在连续添加新的交换溶液下，平衡不断按正方向进行，直至完全把离子交换剂上的原子离子全部洗脱下来。蛋白质的离子交换过程包括吸附和解吸附两个阶段。吸附在离子交换剂上的蛋白质通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而达到解离，或者通过增加离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置，使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。
（二）凝胶色谱层析：其分离纯化蛋白质的原理是分子筛效应：样品溶液流经凝胶色谱柱时进行垂直向下的移动和无定向的扩散运动。再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子物质直径大、不易进入凝胶颗粒的微孔，只能分布在颗粒之间，洗脱时向下移动的速度较快；小分子物质在凝胶颗粒间隙中扩散的同时进入凝胶颗粒微孔，向下移动时，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后在进入另一凝胶颗粒，下移伴随扩散，因此小分子物质的下移速度落后于大分子物质。 二、实验试剂
0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）配制时配×10倍浓缩液1000ml；葡聚糖凝胶Sephadex G-200等。NaCl；聚乙二醇；DEAE－纤维素 DE—52。 三、操作步骤
（一）1. DEAE－纤维素的处理及装柱
（1）处理：本实验采用的是DEAE－纤维素 DE —52弱碱型阴离子交换剂，具体处理方法为：先将DE —52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5N的Hcl溶液中浸泡1—2h，用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或pH4以上，并将其在抽滤斗中抽干；将抽干的离子交换剂浸泡在0.5N的HCl溶液中浸泡1—2h，再用无离子水或蒸馏水洗至中性。
（2）装柱：将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材，轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2 cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白检测议，待层
析柱的平衡。
（3）平衡：在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程中的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5－1 ml/ min，当下出口流出液的pH值与平衡缓冲液的pH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）预先将DE—52柱进行平衡。
2.上样：将粗酶液上柱，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱杂蛋白。
3.洗脱：用含有0.2-0.6MnaCl的0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）进行梯度洗脱。
4.收集PPO活性部分洗脱液，测定酶活性和蛋白浓度。 （二）1.葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡
（1）柱材处理：称取一定量的Sephadex G－200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48 h，去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。
（2）装柱：将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2 cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白检测议，待层析柱的平衡。
（3）平衡：将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2 cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白检测议，待层析柱的平衡。在本实验中用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）平衡Sephadex G－200凝胶。 2.上样：将浓缩酶液上柱（含蛋白不超过4%，但不能太低）。
3.洗脱：用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。
4. 测定酶活性和蛋白浓度 四、结果与分析
（一）在上一步凝胶层析纯化后挑选的蛋白含量和酶活最高的一管收集液进行离子交换层析PPO中的蛋白含量与酶活性如下表所示: CK 粗酶液 蛋白含0 量 酶活性 0 0.25 0.02 0.04 0.02 0.24 0.44 0.04 0.07 0.385 0.023 0.031 0.010 0.178 0.306 0.343 0.171 1 2 3 4 5 6 7 从OD值的大小，可以得知粗提液的蛋白含量是最高的。其他几个不同时间段所接收的洗液第6号试管的蛋白含量最高。第5管酶活性最大，蛋白含量第5管也不低，可以认为第5管就是多酚氧化酶最集中的一管。
（二）凝胶色谱层析纯化后PPO中的蛋白含量与酶活性如下表所示： 蛋白含量 酶活性 从OD值的大小可以得知第2管的蛋白含量是最高的。粗酶的含量是0.023，明显比第2管低，可见层析后对酶有浓缩的作用。可以认为第2管就是最集中PPO最集中的一管。 五、结论与讨论
1. 上样时要控制好速度，不可使胶干了。 2. 反应时加入酶标板后要充分混合。
3. 上样前一定要先平衡层析柱，保证样品在层析柱内时所处的pH及离子强度环境一致减少样品的分解变性。 4. 上样之后就要立即接收洗液。
5. 测定酶活时加入底物后要静置一段时间让底物充分反应后再测。这样测出来的结果才比较准确。
0 0.045 0.08 0.13 0.12 0.03 0.02 0.03 0.01 0.00 0.01 CK 粗酶液 0 0.023 0.092 0.254 0.171 0.129 0.144 0.140 0.101 0.077 0.178 1 2 3 4 5 6 7 8 9
实验5 酶含量和活性测定
1、考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度
一、实验原理与目的
生物化学实验中，经常需要测定蛋白质的含量，一般常用的蛋白质测定方法有紫外吸收法，双缩脲法和Lawry法等。另一种方法是蛋白质－染料结合法，即考马斯亮蓝G－250法。此方法试剂简单、经济。测定简便快速。具有与Lawry法相当的灵敏度，受溶液中其他物质的干扰很小，可采用对照来消除。 考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度的基本原理是：当考马斯亮蓝G－250染料与蛋白质结合时，其存在两种不同颜色（红色与蓝色），红色就转变为蓝色，使染料的最大吸收峰从465 nm移动到595 nm，染料与蛋白质的结合与595 nm的吸收值在一定蛋白质浓度下呈线性相关，其蛋白结合反应在2－3 min内即可完成，而反应生成的复合物在1 h内比较稳定地存在于溶液中，因此，用标准浓度的蛋白测得O.D595值绘制标准曲线，即可求得待测样品的蛋白质浓度。 二、材料与试剂
1.材料：经硫酸铵沉淀获得PPO粗酶液，DEAE－纤维素DE 52分离的酶液和Sephadex G－200分离纯化的酶液样品。 2.试剂：（1）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂：
称取100 mg考马斯亮蓝G－250溶于50 ml 90％的乙醇中，加入85％（V/V）磷酸100 ml，最后加无离子水或蒸馏水定溶到1000 ml，此溶液可在常温下放置一个月。
2 、 PPO活性测定
一、实验原理
PPO催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠—0.1M柠檬酸缓冲液pH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。 二、实验材料与试剂
1.材料：多酚氧化酶粗酶液、硫酸铵沉淀组份、DE—52洗脱组份、葡聚糖凝胶洗脱组份
2.试剂：0.01M邻苯二酚溶液、0.2M磷酸氢二钠—0.1M柠檬酸缓冲液pH5.8 三、操作步骤
在含有4ml pH5.8的0.2M磷酸氢二钠—0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml、浓度为0.05M的邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液，反应5min，在分光光度计410nm处读取吸光值。
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