综述：大肠杆菌中重组蛋白的表达：进展与挑战

CNBr切割甲硫氨酸C端的肽键。目的蛋白内部不能含有甲硫氨酸。CNBr切割可以在通常的变性条件（6M盐酸胍）下进行或者70%formic acid 或者trifluoroacetic acid中进行。

问题三：选择哪一种宿主菌合适？

从文献中快速搜索合适的大肠杆菌菌种作为表达宿主，可以的到几十个可能的结果。各有优缺点。然而，需要注意的是许多都是在特殊情况下才回使用的特殊菌种。在最初的选择中只有几个菌种是必要的：BL21（DE3）和一些K-12直系的几个衍生菌种。

经过多次对B line的不同的修饰，BL21菌种由studier在1986年提出。几个遗传特征值得一提。和其他母本B菌种一样，BL21是lon蛋白酶缺陷型的。Lon蛋白酶可以降解许多外源的蛋白。另外一个基因缺失是编码外膜蛋白酶OmpT的基因。ompT可以降解胞外蛋白。降解产生的氨基酸被细胞吸收。如果表达重组蛋白，当细胞裂解后，Ompt可以消化目的蛋白，这很麻烦。另外，对母本菌株B834进行一个hsdSB突变，可以抑制质粒的丢失，由此得到BL21菌株。DNA甲基化和降解被阻断了。当目的基因处于T7启动子下游，就需要T7RNA聚合酶。在守欢迎的Bl21（DE3）菌株中，λDE3前噬菌体插入BL21的染色体中，在lacUV5启动子下游包含T7RNA聚合酶基因。

BL21（DE3）和他的衍生菌株是迄今为止使用最多的表达菌种。K-12菌系用来表达重组

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蛋白也仍然有所报道。AD494和Origami菌株是trxB（thioredoxin reductase）突变型，因此二硫键在胞质中的形成能力增强了。Origami菌株也缺少谷胱甘肽还原酶基因。另一个广泛使用的菌株是来自K-12系列的HMs174，一个recA突变体。这个突变可以促进质粒的稳定。基于大肠杆菌重组系统的质粒多聚体的形成是导致质粒不稳定的主要因素。所有这三个菌株都有包含λDE3的衍生物，因此都可以应用T7RNA聚合酶系统。

问题4：应该使用哪一个组合才能保证成功？

在这一点上，我们应该很清楚，当设计一个表达系统是选择是相当多的。选择完美的组合is not possible a priori，因此为了得到目的蛋白需测试多个条件。如果一个项目需要表达两个蛋白，克隆到六个不同的表达载体中，每个载体转化入三个不同的表达菌种，那么你要做36组试验。如果要考虑其他变量，这个数值会更高。如果在放大之前进行微表达实验，这个试错而且耗时的pilot study 可以变得更快。小量的表达筛选可以在2ml管子或者96孔板中进行。

TROUBLESHOOTING RECOMBINANT PROTEIN PRODUCTION

这一部分介绍了在大肠杆菌中重组表达优化的不同策略。即使对宿主和质粒的经过了认真的选择，我们仍然无法预料是否可以获得大量的，可溶有活性的蛋白。不幸的是，在实现这些目标所遇到的各种困难经常会发生。 表达量很低或者没有表达

这可以被认为是最差的情况了。当目的蛋白用很灵敏的技术也不能检测到（比如，western blot）或者可以检测但是量非常低（低于毫克/L）。这常常是因为异源蛋白对细胞有毒害作用。 蛋白毒性

当重组蛋白在宿主细胞中发挥了不必要和有害的功能时，蛋白毒性的问题出现了。这些功能干扰了微生物体正常的增殖和稳态。表现出来的特征就是生长缓慢，细胞终浓度低和死亡。

作为第一次测量，在诱导之前应该监测细胞的生长。如果重组菌生长速率比不携带质粒的细菌生长慢，那么有两点可以解释这个现象：基因毒性和毒性mRNA或者蛋白的本底表达。

如前所述，来自与lacI或者lacI基因的LacI的表达可以抑制基于lac的启动子。对

Q于高拷贝的质粒（>100个拷贝/细胞），lacI应该克隆在表达载体上。pQE载体利用两个lac启动子序列来提高对T5启动子的控制。T5启动子是由大肠杆菌的RNA聚合酶识别。因为在含有tryptone或者peptone的富营养培养基中可能会含有诱导剂乳糖，在培养基中加入0.2-1% W/V的葡萄糖可以实验对表达的严谨型控制。另一个选择是选用以葡萄糖为碳源的defined培养基。在基于T7启动子的启动子中，渗漏表达可以通过与来自pLysS或者pLysE质粒的T7溶菌酶共表达来避免。采用含有严谨控制启动子的低拷贝质粒（例如araPBAD启动子）也是一个选择。拷贝数控制的一个有趣的离子是pETcoco载体（Novagen）。这些质粒具有两个复制起点。oriS起点和它的控制元件，可以将pETcoco控制在每个细胞一个拷贝。然而，TrfA replicator激活中拷贝复制起点（oriV）而实现拷贝数的扩增（达到40拷贝/细胞）。TrfA基因是在同一个载体上，受到araPBAD启动子控制，因此拷贝数可以由阿拉伯糖控制。

控制了本底表达之后，培养物应该是生长良好，直至诱导。此时，如果蛋白是有毒性的，细胞生长会停滞。在许多情况下，当达到并超过宿主容忍度，某个一个蛋白的毒性水平变得明显。在这种情况下，表达水平可以随意控制。使用Lemo21（DE3）菌株可以实现Tunable表达。这个菌种与BL21（DE3）pLysS菌种相似，然而，T7溶菌酶是来自受到tunable启动子rhaPBAD控制的lysY基因。在高浓度的L-rhamnose糖存在下，会产生更多的T7溶菌酶，细胞内会有更少的T7RNA聚合酶，会表达更少的重组蛋白。为了确定最佳的表达条件，需要检测0-2000μM L-rhamnose糖对表达的影响。相反，当采用IPTG作为诱导剂时，不能实现剂量依赖的表达，因为IPTG可以通过Lac透过酶或者渗透非依赖多肽途径激活转运进入细胞。而Lac透过酶的表达是异源的而且活性透过酶的数量是高度可变的，蛋白表达不会可预

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测地随着IPTG浓度变化。Tuner（DE3）菌株（Novagen）是一个BL21的衍生菌株，包含一

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个lac透过酶的突变（lacY），使IPTG均等地进入LacY细胞，使诱导在一个浓度依赖，

c均一的水平。同样，通过将lacO替换野生型的启动子构建了一个大肠杆菌菌株，将lac启

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动子转换为一个连续的启动子。这个修饰避免了一部分细胞的瞬时的非遗传的LacY的表型，使诱导剂乳糖同步地进入。第二个修饰（gal+）可以使细菌完全利用乳糖作为碳源。

有一点需要注意，tunable启动子可以被糖类诱导（乳糖，阿拉伯糖，rhamnose）。对于araPBAD启动子，通过补充不同浓度的阿拉伯糖，目的蛋白的产量可以增加100倍。这使人们错误地认为重组蛋白的合成水平可以随意控制。然而，蛋白表达水平随着活性糖透过酶的多相性而改变，与LacY相似。因此，即使蛋白终产量可以控制，每个细胞的蛋白量是高度可变的，有些可以表达大量蛋白，而有些细胞根本没有蛋白。

为了表达一些有毒性的蛋白，需要专门选择一些大肠杆菌的突变体。在一次对提高膜蛋白生产的Bl21（DE3）的衍生菌株的筛选分离中，Miroux 和Walker发现了C41(DE2)和C43（DE3）菌株。最近发现，以前在表达重组蛋白过程中阻止细胞死亡的未明确特征的突变体存在于lacUV5启动子。在BL21（DE3）细胞中，lacUV5启动子趋势T7RNA聚合酶的表达，但是在Walker菌株中在-10区的两个突变使lacUV5启动子回复到更弱的野生型。这导致重组蛋白合成量更少（可能细胞耐受更强）。

另一个解决方案是将蛋白从细胞中移除。分泌到周质或者培养基有时是唯一的生产重组蛋白的方法。周质表达的第一个选择是翻译后的Sec-依赖途径。将一个合适的前导肽融合到重组蛋白上，可以使蛋白运输到周质空间。广泛使用的用来分泌的信号肽包括：Lpp, LamB, LTB, MalE, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, PelB, PhoA, PhoE, 或者 SpA。也可以采用基于SRP（信号识别颗粒）路径的共翻译转运机制。SRP识别N端的疏水性信号序列。与膜受体FtsY相互作用之后，新生链和核糖体复合物被转运到SecYFG 转运酶。通过SRP途径，二硫键异构酶I（DsbA）也被用来将重组蛋白转移到周质中。

Q密码子偏好

密码子偏好发生在外源编码DNA的同义密码子与宿主密码子有很大不同时。在合成全长重组蛋白时，低丰度的tRNA逐渐消耗净。这种缺失导致氨基酸错误的加入和/或产生不完整多肽，因此影响异源蛋白的表达水平和/或活性。表达重组蛋白要检查是否有密码子偏好问题时，可以使用很多免费在线应用来检测一段基因中的稀有密码子（molbiol.ru/eng/scripts/01_11.html, genscript.com/cgibin/tools/rare_codon_analysis, nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/，等等）。稀有密码子是在大肠杆菌中使用频率在1%以下的密码子。

解决密码子使用偏好问题有两个策略：外源编码序列优化或者通过修饰宿主提高稀有tRNA的数量。密码子使用优化的原理是依照宿主密码子使用偏好修改目的基因中的稀有密码子。在这个过程中蛋白的氨基酸序列不能改变。这可以通过定点沉默突变或者重新合成整个基因或者一部分。通过沉默突变来优化密码子是一个费力的而且昂贵的过程，因此对于生产许多重组蛋白来说并不实用。另一方面，基因合成简单得多，因为他只需要从海量的组合中选择最合适的序列。

改正密码子使用是一个棘手的事情。“一个氨基酸一个密码子”策略没有考虑到除了密码子稀少以外的影响蛋白表达水平的因素。例如，在细菌基因N端富含稀有密码子，蛋白表达实际上是增加的。这个原因并不在于密码子稀少而是RNA二级结构的减少。另外，最近研究表明高水平蛋白表达主要（不仅仅）是由开放阅读框的解码数度决定（比如，核糖体翻译一个mRNA所需要的时间），尤其是当（快的）密码子处于mRNA的5’端。这导至起始位点的核糖体快速的消失，因此新的核糖体遇到一个空的其实密码子并快速的参与到翻译当中。最后，一些密码子的组合可以形成类似SD的结构，导至翻译通过mRNA与翻译核糖体的16S rRNA杂交终止。沿着mRNA的翻译终止对蛋白折叠有有利的一面，因为它允许新合成的链形成合适折叠的中间构象。所有这些翻译控制机制对合成基因比例的设计构成了一个挑战。更新的算法应该考虑到5’RNA结构，类SD结构的存在，起始位点核糖体的清空率和对共翻译折叠有利的翻译缓慢区域的存在。

另一方面，当细胞生产大量的蛋白（异源基因表达的蛋白），编码稀有密码子带电荷的rRNA成为决定蛋白表达的主要因素。低丰度的tRNA消耗导致核糖体停止，然后与RNA链脱离，导致不能产生全长的产物。几种菌株携带包含额外的tRNA基因的质粒可以解决这个问题。BL21(DE3)CodonPlus菌株（Stratagene）包含pRIL质粒（p15A复制子，可以与含有ColE1和类似ColE1复制起点这些最常用的表达载体兼容），可以提供AGG/AGA (Arg), AUA (Ile), and CUA(Leu)的tRNA基因。BL21(DE3)CodonPlus-RP (Stratagene)修改了AGG/AGA

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(Arg) 和 CCC (Pro)的使用。Rosetta(DE3) 菌株 (Novagen) 和 TunerRosetta(DE3) 菌株

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(Novagen) 是 Tuner的衍生菌，含有pRARE质粒（p15A复制子），可以提供所有上面提到的密码子，另外还有GGA（Gly）。应该注意的是这些菌种的使用通常会提高蛋白表达量但是有时候会导致蛋白可溶性的降低。我们已经发现那些RIL（AGG/AGA,AUA, 和CUA）密码子含量超过5%的蛋白在Codon-plus菌种中表达时可溶性较差。在这些宿主中，有RIL密码子导致的翻译终止可能无效，导致翻译速度提高，最终导致蛋白聚集。 分批培养的制约因素

当重组蛋白的表达量很低，通过不同的机制也无法提高，那么目的蛋白的量可以通过使培养基达到更高的浓度来放大。这可以通过改进几个参数来实现，比如培养基成分和通过剧烈的摇动来提供更好的通气。

LB培养基是培养大肠杆菌使用最多的培养基。这种培养基容易配制，富含营养成分，其渗透压对于细菌对数后期的生长是最优的。所有这些特征使LB培养基足够适用于蛋白表达，虽然它并不是获得高浓度培养物的最佳选择。这是因为LB培养基中碳水化合物（和其

他可用的碳源）和二价阳离子的含量非常少。理所当然，增加胰蛋白胨或者酵母提取物可以提高细胞的浓度。补充二价阳离子（毫摩尔水平的MgSO4）也会提高细胞浓度。加入葡萄糖却没有太大的作用，因为葡萄糖代谢产生的酸超过了LB的缓冲能力。而在摇瓶中控制pH是非常费事的。如果培养物的酸化构成一个问题，培养基可以用50mM的磷酸钠盐作为缓冲液。2×YT，TB（Terrific Broth）和SB（Super Broth）培养基的成分很容易得到，对于培养高浓度细胞，优于LB培养基。

培养基成分的一个主要的突破来自于2005年Studier的进一步的工作，在那篇报道中发展了自动诱导的概念。在自动诱导培养基中，葡萄糖，乳糖和甘油被用作优化的混合物。葡萄糖是优先使用的碳源，在细胞生长中首先被代谢。葡萄糖阻止乳糖的吸收，直至葡萄糖消耗干净，这通常发生在在对数中后期。然后是消耗甘油和乳糖，后者也作为lac控制的蛋白表达的诱导剂。这样，避免了为了及时添加诱导剂而检测生物量以及调节培养基。

随着每升培养物中细胞数量的增加，氧气供给对细胞生长产生了巨大的影响。提高溶氧最简单的方式就是提高摇菌的转速。例如，对于一般的三角瓶，最优的转速在400rpm-500rpm。带挡板的三角瓶中的搅动会更剧烈一些，在这些条件下，350rpm-400rpm足以保证很好的通气。然而，剧烈的摇动会形成泡沫，降低氧气的传输。因此，推荐加入消泡剂，尽管消泡剂会影响几种微生物的生长和重组蛋白的产量。合适的通气也取决于培养物所占摇瓶的总体积。一般来说，培养物的体积应该低于摇瓶容积的10%。另一个可以使细胞浓度达到很高的方法是流加式发酵。

在重组蛋白生产是极少讨论的两个参数是种子培养基的准备和诱导时间。大多数程序要求稀释过夜培养的饱和培养物（100倍稀释）到更大体积的培养基中。然而，渗漏表达会导致质粒不稳定，最终导致目的蛋白产量低。在终止培养基中，细胞也处于不一致的代谢状态。通过稀释接种到新鲜培养基中，细胞将会以不同的速率生长，导致不可复制的诱导点。一个合适的方案是，种子培养基可以在20-25℃培养或者使用一个缓慢释放葡萄糖系统。在接种和进一步培养之后，通常是在对数中期加入诱导物，因为在这个时间细胞生长快速，蛋白翻译达到最大。然而，也可以在稳定期早期诱导。实际上，在一些情况下，在这个阶段诱导目的蛋白可溶性更高。很可能是因为蛋白合成的减慢降低了包涵体的聚集。 包涵体的形成

当一个外源基因转入大肠杆菌，spatio-temporal control of its expression is lost。新合成的重组多肽是在大肠杆菌的微环境中表达，这个微环境与多肽原来的环境可能有所不同，例如pH，渗透压，redox potential, cofactors,和折叠机制。在高水平的表达中，多肽中的疏水张力也会以很高的浓度存在，相似的区域会相互作用。所有这些因素会导致蛋白质不稳定和聚集。这些蛋白质聚集体称为包涵体。包涵体的形成是由于蛋白聚集状态和可溶状态的不平衡导致。因此，通过改善导致包涵体形成的因素来获得可溶的重组蛋白是可能的。一个方法就是将目的蛋白融合到一个助溶标签上。在一些情况下，形成包涵体是有优势的，尤其是当这个蛋白可以容易地在体外重新折叠。如果是这样的话，可以调整条件以利于包涵体的形成，提供了一个重要的一步纯化表达蛋白的简单方法。 二硫键的形成

对于许多重组蛋白来说，二硫键的正确形成对于获得有生物活性的三维构象是至关重要的。错误的二硫键形成会导致蛋白的错误折叠，聚集为包涵体。在大肠杆菌中，半胱氨酸的氧化发生在周质空间，在这里二硫键是由大量的酶催化形成的。主要的酶是Dsb家族。相反，二硫键在细胞质中很少折叠，可能是因为半胱氨酸残基是在许多酶中是催化位点的一部分。在这些位点的二硫键的形成可能会导致蛋白的失活，错误折叠和聚集。在细胞质中具有更低的氧化还原电势，细胞质是由trxB系统和gor系统保持在一个还原的环境。这中情况对含有二硫键的蛋白质的表达有巨大的影响。一个选择就是使蛋白分泌到周质表达。