端粒长度检测方法

端粒长度检测方法：

实时荧光定量PCR分两部分进行，分别测定端粒和内参基因RPLPO（核糖体大亚基PO蛋白基因）的Ct值，每次反应需要设定标准曲线。端粒（T）重复拷贝数与单拷贝基因（S）的比率，即T/S比率可以得出端粒的相对长度，而T/S比率与端粒长度成正比关系。T/S计算公式如下：

T/S= [2CT(telomeres)/2CT(single copy gene)]=2-ΔCT

1基因组DNA的提取

1. 提取人外周血基因组DNA

以试剂盒提取获得人外周血基因组DNA。

2实时荧光定量PCR测定DNA端粒长度

1. 引物序列

端粒 Tel 1：浓度675 nmol/L

序列 5’-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3’

端粒 Tel 2：浓度1350 nmol/L

序列5’-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3’

RPLPO基因 hRPLPO1：浓度800 nmol/L

序列5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA -3’

RPLPO基因 hRPLPO2：浓度800 nmol/L

序列5’-CAGCAAGTGG-GAAGGTGTAATCC -3’

2. 标准曲线制作

选取同一血样基因组DNA为标准品，使用等比稀释，稀释系数为2，浓度范围为：0.25-64ng/μl，即可稀释得9个浓度梯度，分别为64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25 ng/μl，制作的标准曲线R2>0.98。

3. 反应体系 （每个样设置品三个重复）

10μl反应体系

gDNA

Master Mix (quantiTect SyberGreen PCR kit)

10ng Up to 10μl

注：内参及样品反应体系中，Master Mix 除了引物不同外，其余成分均相同

另一文献所述的反应体系

25μl反应体系

SYBR Premix Ex Taq (2X)

gDNA 端粒Tel 1 (内参基因 hRPLPO1) 端粒Tel 2 （内参基因 hRPLPO2）

dH2O

12.5μl

1.0μl (约60ng/μl) 0.625μl （1μl） 2.25μl （1μl）

Up to 25μl

4. PCR反应条件

95℃ 10 min 95℃ 15 sec 54℃ 2 min

54℃检测荧光强度，35个循环 72℃ 10min

参考文献：

[1]Sonia Garc?′a-Calzo′n，Adriana Moleres，Ascensio′ n Marcos et al. Telomere Length as a Biomarker for Adiposity Changesafter a Multidisciplinary Intervention in Overweight/ Obese Adolescents: The EVASYON Study

[2]吕昆，林丹，许淼 等.应用实时荧光定量PCR测定牛体细胞端粒长度 [3]王敏敏，杨浩，刘广义 等.荧光定量PCR测定端粒长度