dSDNA=50*(OD260—OD310)*稀释倍数 SSRNA=40*(OD260—OD310)*稀释倍数
1μg/mL DNA溶液OD260等于0.02 1μg/mL 的RNA或单链DNA溶液OD260等于0.022~0.024 1个OD260相当于 50μg/mL 的双链DNA，37μg/mL单链DNA，40μg/mL的RNA，30μg/mL的寡核苷酸 5、DNA电泳影响因素：
（1）DNA分子大小：DNA分子越大，在凝胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。
（2）DNA分子构型：不同构型的质粒DNA分子即使具有相同分子质量，电泳迁移速率也不同，超螺旋最快、线状分子次之。开环分子最慢。
（3）凝胶浓度：对于同种DNA分子，凝胶浓度越高，电泳速率越慢；浓度低的胶线性范围较宽，而浓度高的凝胶对小分子DNA片段呈现较好的线性关系。 （4）电场强度：电场强度高（5V/cm），电泳速度快，但分辨率低。 （5）溴化乙锭（EB）：其具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，可用作DNA染色剂。
（6）电泳缓冲液：目前有TAE（多用，时间短成本低）、TBE、TPE3种 6、核酸分子杂交：实质上是双链DNA或者具有二级结构的RNA变性后，其具有互补序列的两条单链的退火复性过程。应用于重组子鉴别、基因分离、DNA片段分析、基因表达研究等
7、Southern杂交应用：遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等，例如在研究转基因的时候，可用于检测外源基因的插入和整合情况。
8、Northern杂交应用：是检测、定量mRNA大小及在组织中表达水平的标准方
法，既是能直接提供有关RNA完整性、不同的剪接信息及mRNA大小等信息的唯一方法，也是在同一张膜上直接比较同一信息在不同样品中的表达丰度的首选方法。
9、Western杂交应用：主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。
10、PCR技术原理：DNA在高温时可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做引发子，加入DNA聚合酶、dNTP完成特定基因的体外复制。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。
12、PCR技术的基本过程：变性、退火和延伸
（1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
（2）模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
（3）引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的\半保留复制链\，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 13、PCR的反应体系含有哪些基本成分？ 缓冲液、模板、dNTP、耐热的DNA聚合酶、引物
和体内复制相比较，PCR体外反应体系还需要加耐热的DNA聚合酶 DNA聚合酶应用区别：
TaqDNA聚合酶：扩增效率最高的耐热DNA聚合酶，能很好的扩增6kb以下的DNA 片段。扩增碱基出错率为10-5左右。
PfuDNA聚合酶：目前保真度最高的耐热DNA聚合酶，碱基出错率为10-6，但扩增效率低于Taq酶，一般能很好的扩增2kb以下的片段。 14、提取DNA、RNA的步骤主要有哪些？需要注意哪些问题？
DNA提取：（1）细胞裂解和DNA的溶解 （2）与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除 （3）DNA的沉淀和纯化 注意问题：
RNA的提取：（1）细胞的有效破碎 （2）使核蛋白复合体充分变性、解离，使核酸释放到溶液中 （3)有效地抑制内源及外源RNase活性 （4）将RNA与DNA、蛋白质和多糖分开 注意的问题：
15、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳和脉冲电泳的原理是什么？影响因素有哪些？各有什么用途？
（1)琼脂糖凝胶电泳：是以琼脂糖为支持物，在适当条件下对带电生物大分子进行电泳的技术，主要用于DNA分子的分离、纯化和鉴定。影响因素：1）DNA分子大小 2）DNA分子构型 3）凝胶浓度 4）电场强度 5）溴化乙锭 6）电泳缓冲液
（2)聚丙烯酰胺凝胶电泳：是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物介质的垂直凝胶电泳，可根据电泳样品的电荷、分子大小及性状的差别分离物质。适用于小分子DNA、寡聚核苷酸和蛋白质的分离。影响因素：电场强度、分子静电荷量、分子大小和形状以及介质的离子强度、黏度和温度。
（3)脉冲电泳：是一种交替变换电场方向的电泳，它以一定的角度并以一定的时间改变电场的方向，是DNA在微观上按“Z”字形向前泳动，从而达到分离相对分子量大的DNA片段的目的，可使50Kb以上，甚至Mb级的大片段DNA。影响因素：电场方向、电流大小及作用时间。
16、分子杂交的原理是什么？有几种类型？各有什么作用？
核酸分子杂交实质上是双链DNA或者具有二级结构的RNA变性后，其具有互补序列的两条单链的退火复性过程。 有核酸和蛋白质两种类型 应用于重组子鉴别、基因分离、DNA片段分析、基因表达研究等 17、设计引物应遵循以下原则：
1、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
2、引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3''端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
4、引物3''端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
5、引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
6、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 7、引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物
相关推荐：
loading