基因工程重点

之间形成二聚体的机会。

18、实时定量PCR的原理是什么？有哪些应用？

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程最后通过标准曲线对模板中特定基因进行定量分析 应用：对特定核苷酸片段进行指数级的扩增

第五章

一、名词解释：

1.RACE：即cDNA末端的快速扩增技术，是一种根据已知部分cDNA序列扩增未知序列，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的PCR技术。 或者

2.RACE：即cDNA末端的快速扩增技术，是一种根据已知部分cDNA序列扩增未知序列的PCR技术。这种方法是根据基因编码蛋白的同源性或多个同源基因cDNA比较的变异情况，将同源基因cDNA的核心区段分析出来，针对核心区段保守性高的位点设计引物，然后运用RT-PCR克隆技术核心序列区。

3.简并序列：由于一个氨基酸可对应一个到多个密码子，因此一段氨基酸序列可以有多个可能的编码序列。

4.基因组文库：简称基因文库，是将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。

5.cDNA文库:是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录。 或者

6.cDNA文库:以特定的组织或细胞mRNA为模板，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。 二、思考题

1.通过查阅资料了解5’RACE克隆的几种具体方法和实验流程？ 答：方法与实验流程：

（1）利用烟草碱性磷酸酶将mRNA5’端的帽子结构切除，然后利用

T4RNA连接酶上一段已知序列的寡核苷酸，RACE时可将它作为设计上游引物的依据。

（2）利用特殊反转录酶法，在反转录到cDNA的末端时，加上了几个多余的C碱基，在体系中加入3’端为几个G碱基的已知序列寡核苷酸，在合成cDNA末端加上一段延伸的序列，作为上游引物的位点，在反转录酶的作用下，利用oligo作引物合成cDNA第一链，反转录酶在cDNA第一链末端延伸合成了几个C碱基，体系中加入的3’端为G碱基的寡聚唐序列与cNDA末端互补，作为cDNA继续延伸合成的模板，在cDNA的末端合成出一段已知序列，形成5’RACE的引物位点。 （3）在cDNA第一链利用末端转移酶加上一段寡聚核苷酸作为引物结合的序列。（末端脱氧核糖核酸转移酶法） （4）单链cDNA分子环化法

2、什么是简并引物？设计简并引物时怎样降低简并度？

答：简并引物：是合成一段作PCR扩增体系的简并序列的引物即为简并引物。 简并度越低，产物特异性越强，所以设计简并引物时在选取氨基酸序列时应选取对应密码子较少的残基，放弃最后一个氨基酸放弃其密码子的第3为碱基

（避免引物3’末端兼并）。

3、基因文库要满足什么条件？有哪些类型的基因文库？

答：（1）基因文库要满足的条件：①首先要满足文库的完整性，即文库应包含基因组的完整序列信息。②基因组信息的可重建性。③基因组文库的大小，即文库中应包含的独立重组子数目。

（2）基因文库的类型：按其克隆的载体分，通常有质粒文库、噬菌体载体文库、粘性粒文库、细菌人工染色体文库和酵母人工染色体文库等。 4、cDNA文库必须满足什么条件，其构建包括哪些步骤？

答：条件：①cDNA文库的代表性，即文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性；②文库中的重组cDNA片段的序列完整性。

（2）步骤：细胞总RNA的制备及分离、cDNA第一链的合成、双链cDNA的合成、双链cDNA与载体的连接和噬菌体颗粒的包装及感染宿主细胞等。

①总 RNA 的提取 RNA 提取程序一般包括：沉淀细胞、裂解细胞、离心除去细胞残渣。②分离mRNA 分离mRNA前，需先分离总RNA，一般利用异硫氰酸胍和β-巯基乙醇是核糖体解体，后通过沉淀得总RNA。在合成cDNA第一链之前应对其完整性进行检测。③对mRNA进行富集，即通过一定的方式使特定的mRNA分子在体系中的比例增高。④cDNA的合成 cDNA第一链的合成是以mRNA分子为模板，在反转录酶的作用下，利用适当引物引导DNA合成的过程。mRNA3’端为polyA尾为cDNA第一链的合成提供了一个很好的引物位点。⑤黏性末端片段与载体的连接 为cDNA双链分子方便克隆入相应载体，常在oligo寡聚引物一端接上含有特定限制性核酸酶黏性末端的接头分子。⑥离体包装获得重组噬菌体 ⑦检测重组噬菌体效价。

第4题百度的答案是如下：

条件：1 、要使用mRNA经过反转录PCR产生cDNA. 2 、要进一步获得cDNA全长

3 、加适当接头,连接到适当的载体内. 4 、转化受体细胞,构建为cDNA文库.

基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定),要构建一个高质量的cDNA 文库,获得高质量的mRNA 是至关重要的,所以处理mRNA 样品时必须仔细小心.由于RNA 酶存在所有的生物中,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境,因此建立一个无RNA 酶的环境对于制备优质RNA很重要.在获得高质量的mRNA 后用反转录酶Oligo(dT) 引导下合成cDNA 第1链,cDNA 第2链的合成(用RNA酶H和大肠杆菌DNA 聚合酶I,同时包括使用T4噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA连接酶进行的修复反应),合成接头的加入、将双链DNA克隆到载体中去、分析cDNA插入片断.扩增cDNA 文库、对建立的cDNA文库进行鉴定.

第六章

一、名词解释

1、感受态细胞：就是处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞。 二、相关知识重点 <一>黏性末端的连接应用

（1）同一种酶产生的黏性末端的连接

当带有相同黏性末端的DNA片段一起退火，并在DNA连接酶的催化作用下黏性末端的单链之间便可进行碱基配对，被共价地连接起来形成重组DNA分子。例