基因工程重点

状的重组质粒。

（在平末端不存在酶切位点的情况下，则要在末端添加衔接物或含BamHI酶切位点的接头，然后再进行酶切连接） <八>重组子筛选主要有哪些方法？ 答：1、载体表型选择法

（1）、抗药性标记插入失活选择法 （2）、β—半乳糖苷酶显色反应选择法 2、根据插入基因的表型选择法 3、DNA电泳检测法 4、PCR检测法 5、核酸杂交检测法 6、免疫化学检测法

（1）放射性抗体检测法（2）免疫沉淀检测法（3）表达载体产物的免疫化学检测法

7、DNA序列分析

<九>为什么pUC系列的载体与外源基因形成的重组体可用蓝白斑实验进行筛选？

答：pUC系列载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5′-端带有一段多克隆位点的lacZ′基因。

pUC系列载体的多克隆位点区处于β-半乳糖苷酶的α肽编码区内，插入外源DNA片段后，α肽编码区错位，α肽失活，在将连接载体转入宿主细胞后，加入IPTG诱导和X-gal后，插入外源基因的载体菌落失去产生颜色的功能而呈白色，而没插入的菌落呈现蓝色，可以很方便的通过辨识菌落的颜色筛选到阳性克隆

<十>某一质粒载体有tetr和ampr的表型，在ampr中有一EcoRI的酶切位点，现用EcoRI切割载体进行基因重组，问如何用抗性变化筛选含有插入片断的重组体？

答：因ampr上识别位点被EcoRI切割，故该质体将失去抗Amp的表型。将酶切后的质粒组装成的重组体转化菌先涂布在含有四环素的平板上生长，再将存活的菌落原位影印到另一个含有氨苄青霉素的平板上。在四环素平板上生长而在氨苄青霉素平板上不生长的菌落，即表明已筛选到含有插入片段的重组提质粒。

第七章

一、名词解释：

1、基因表达：遗传信息从DNA→RNA→蛋白质的过程

2、阅读框架：又称开放阅读框架，是基因的编码区，包含从起始密码子至翻译终止密码子之间的cDNA序列。

3、顺式作用元件：是在转录水平上对基因表达有调节活性的DNA序列，包括启动子、增强子、沉默子和衰减子等，多位于基因旁侧或内含子中，一般只调节与其处于同一个DNA分子上的基因。

4、启动子：是RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一段DNA序列

5、增强子：是远距离调节启动子并提高转录效率的一段DNA序列，由多个元件组成，每个元件可与一种或多种转录调控因子结合。

6、沉默子：是远距离调节启动子以降低转录效率的一段DNA序列，是调节基因表达的顺式作用负调控元件。

7、终止子：是为转录提供终止信号的一段DNA序列，是基因表达的顺式作用负调控元件。

8、衰减子：是原核生物基因表达调控的精细调节装置，是基因表达的顺式作用负调控元件。

9、SD序列：是翻译起始密码子（AUG）上游5～13个核苷酸处的一段富含嘌呤5’-UAAGGAGGU-3’的全部或其中的一部分序列，在翻译起始阶段与核糖体小亚基16SrRNA的3’端相互作用，以正确定位起始密码子。 （注：4-9为选择题）

10、启动子、增强子起到正调控作用，沉默子、终止子、衰减子起到负调控作用。 （为选择题） 二、问答题

1、原核生物基因表达与调控的特点：

（1）原核生物基因表达一般以操纵子为单位。操纵子是原核生物基因表达和调控的协同单元，由数个功能相关的结构基因及其调控区组成，调控区主要分为三部分：操纵基因、启动基因及其他由调控功能的序列。

（2）原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。

（3）原核生物无核膜，转录和翻译过程是偶联的。

（4）原核生物基因一般不含内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。

（5）原核生物基因表达的调控主要在转录水平，这种控制比对基因产物的直接控制要慢。对RNA合成的调控主要有两种方式：一种是启动子调节的起始控制，一种是衰减子调节的终止控制。

总之，原核生物的基因表达比真核生物简单、快速、表达产量高，是基因工程

表达系统中了解最深入、实际应用最广的表达系统。 2、启动子和增强子有哪些异同点？ 答：相同点：都为表达调控的顺式作用元件

不同点：（1）启动子一般不对称，正反两个方向中只有一种具有启动功能，而增强子能在两个方向产生作用（2）启动子是转录起始位点上游与RNA聚合酶结合的一段DNA序列，而增强子是与启动子作用增强转录的一些片段；（3）启动子只能位于所要启动转录基因的上游或基因内部的前端，才能起作用，而增强子可以在启动子下游或上游，其位置是不固定，而且具有远距离作用 3、大肠杆菌表达载体的必须结构元件有哪些？各个结构元件的作用是什么？ 答：（1）大肠杆菌表达载体的必须结构元件有启动子（包括-35box和-10box两个保守序列）、核糖体结合位点（又称SD序列）、终止子、选择标记基因、复制子。

（2）作用：①启动子：是使RNA聚合酶于启动子结合，驱动基因转录出mRNA ②核糖体结合位点：是翻译起始密码子（AUG）上游5～13个核苷酸处的一段富含嘌呤5’-UAAGGAGGU-3’的全部或其中的一部分序列，在翻译起始阶段与核糖体小亚基16SrRNA的3’端相互作用，以正确定位起始密码子

③终止子：可终止转录，可提高mRNA的稳定性，提高蛋白质的表达水平 ④选择标记基因：可方便从大量的菌落中将被转化的细胞分离出来 ⑤复制子：可识别被受体细胞内相应的、与起始相关的酶和蛋白因子

第八章

名词解释： 1、疏水层析：