第38讲 基因工程及其安全性
1.基因工程的诞生(Ⅰ) 2.基因工程的原理及技术(Ⅱ) 3.基因工程的
应用(Ⅱ) 4.蛋白质工程(Ⅰ)
5．转基因生物的安全性(Ⅰ) 6.生物武器对人类的威胁(Ⅰ) 7.实验：DNA的粗提取与鉴定
[学生用书P272])
一、基因工程的概念理解 1．供体：提供目的基因。 2．操作环境：无菌。
3．操作水平：DNA分子水平。 4．原理：基因重组。 5．受体：表达目的基因。
6．本质：性状在受体生物体内表达。
7．优点：克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物的遗传性状。 二、DNA重组技术的基本工具
1．限制性核酸内切酶(简称：限制酶)
(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)作用：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
(3)结果：产生黏性末端或平末端。 2．DNA连接酶 常用类型 来源 功能 结果 E·coli DNA连接酶 大肠杆菌 连接黏性末端 T4DNA连接酶 T4噬菌体 连接黏性末端和平末端 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 3.载体
(1)种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。 能自我复制??
(2)质粒特点?有一个至多个限制酶切割位点 ??有特殊的标记基因三、基因工程的操作程序
①从基因文库中获取??目的基因
—?②利用PCR技术扩增
的获取
??③通过化学方法人工合成
1
??②启动子基因表达
—组成?
载体构建③终止子
??④标记基因
①植物：农杆菌转化法、
?? 基因枪法、花粉管通道法将目的基因导
—方法?
入受体细胞②动物：显微注射技术
??③微生物：感受态细胞法
①目的基因
?的基因的有无
?
②利用分子杂交技术检测目的基因的?目的基因的 转录
检测与鉴定?③利用抗原—抗体杂交检测目的基因
? 的翻译
④利用个体生物学水平的检测鉴定重?? 组性状的表达
四、基因工程的应用
技术名称 植物基 因工程 动物基因工程 基因治疗 应用 培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物，利用转基因技术改良植物的品质 提高动物生长速度，改善畜产品的品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植的供体 把正常基因导入病人体内，使其表达产物发挥功能，从而治疗疾病，分为体内基因治疗和体外基因治疗 ①利用DNA分子杂交技术检测目
五、蛋白质工程
1．目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。 2．操作手段：基因修饰或基因合成。
3．设计流程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)。
六、转基因生物的安全性 1．转基因成果
(1)工程菌——DNA重组微生物。 (2)基因制药。
2
(3)转基因动物——生物反应器。 (4)转基因农作物。 2．安全性问题
(1)食物安全：滞后效应(产生毒性蛋白质)、新的过敏原、营养成分改变。 (2)生物安全：生物入侵，破坏生物多样性。
(3)环境安全：破坏生态系统的稳定性和人类生活环境。 3．理性看待转基因技术
(1)需要正确的社会舆论导向，趋利避害，不能因噎废食。
(2)制定符合本国利益的政策和法规，最大程度地保证转基因技术和产品的安全性。 七、禁止生物武器
1．种类：病菌、病毒、生化毒剂及经过基因重组的致病菌等。
2．我国政府态度：任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
1．(2016·山东济南市高三期末)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。(×)
2．DNA连接酶可把目的基因与载体的黏性末端的碱基黏合，形成重组DNA。(×) 3．E·coli DNA连接酶既可以连接平末端，又可以连接黏性末端。(×)
4．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。(×) 5．基因表达载体中含有启动子和终止密码。(×) 6．如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同。(×)
7．目的基因导入马铃薯细胞后，随着马铃薯DNA分子的复制而复制，传给子代细胞并表达。(√)
8．(2016·江苏无锡市统考)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。(×)
9．目前在抗菌性和溶血性均较强的多肽P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽。(√)
10．(2014·高考重庆卷T4D)利用基因工程培育抗虫植物时，只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异。(√)
考点一 基因工程的操作工具[学生用书P273]
1．与DNA有关的四种酶
比较项目
限制酶 DNA连接DNA聚合解旋酶 3
酶 作用底物 作用部位 形成产物 DNA分子 磷酸二酯键 黏性末端或平末端 DNA分子片段 磷酸二酯键 形成重组DNA分子 酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 新的DNA分子 DNA分子 碱基对间的氢键 形成单链DNA 2.限制酶
(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称。无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如碱基互补对称。
(2)切割后末端的种类
CCAGGA
，以中心线为轴，两侧碱基互补对称；GGTCC=====以=====T为轴，两侧
(3)限制酶的选择技巧
①根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
a．应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 b．不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
c．为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
②根据质粒的特点确定限制酶的种类
a．所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端。
b．质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不只一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
3．限制酶和DNA连接酶的关系
(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。
4
(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(3)DNA连接酶起作用时，不需要模板。 4．载体
(1)条件与目的
条件 稳定并能复制 有一个至多个限制酶切割位点 具有特殊的标记基因 目的 目的基因稳定存在且数量可扩大 可携带多个或多种外源基因 便于重组DNA的鉴定和选择 (2)作用 ①作为运载工具，将目的基因导入宿主细胞内。 ②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
关于基因工程工具的几个易错点
(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。
(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端或平末端。
(4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
(6)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
(7)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。
(2016·山东烟台市高三统考)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓
↓
GATC、CCCGGG。请回答下列问题：
5
(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由________________________________________连接。
(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中的DNA片段，产生的末端是________末端，其产物长度为________________________________________________________________________
________________________________。
(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段。
(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。 解析：(1)一条脱氧核苷酸链中相邻的两个碱基之间是通过“—脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖—”相连的，要注意与两条脱氧核苷酸链的相邻碱基之间通过氢键相连进行区分。(2)从Sma Ⅰ的识别序列和切点可见，其切割后产生的是平末端，图1中DNA片段有Sma Ⅰ的两个识别序列，故切割后产生的产物长度为537(534＋3)bp、790(796－3－3)bp和661(658＋3)bp三种。(3)图示方框内发生碱基的替换后，形成的d基因失去了1个SmaⅠ的识别序列，故D基因、d基因用SmaⅠ完全切割后产物中除原有的3种长度的DNA片段外，还增加一种(537＋790)bp的DNA片段。(4)目的基因的两端都有BamHⅠ的识别序列，质粒的启动子后抗生素A抗性基因上也有BamH Ⅰ的识别序列，故应选用的限制酶是BamHⅠ，此时抗生素B抗性基因作为标记基因，故筛选时培养基中要添加抗生素B。若重组质粒已导入了受体细胞却不能表达，很可能是因为用同种限制酶切割后，目的基因和质粒有两种连接方式，导入受体细胞的重组质粒是目的基因和质粒反向连接形成的。
答案：(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖 (2)平 537 bp、790 bp、661 bp (3)4 (4)BamHⅠ 抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接
考点二 基因工程的基本操作程序和应用[学生用书P275]
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1．目的基因的获取 (1)直接分离法
??从基因文库（基因组文库或cDNA文库）中获取? ?利用PCR技术扩增?
(2)人工合成法
??化学合成法：针对已知核苷酸序列的较小基因? ??逆转录法：以RNA为模板，在反转录酶的作用下人工合成
2．基因表达载体的构建
(1)基因表达载体的组成及作用
(2)基因表达载体的构建过程
3．将目的基因导入受体细胞 生物种类 常用方法 受体细胞 植物 农杆菌转化法 体细胞 将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 动物 显微注射技术 受精卵 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 2＋微生物 感受态细胞法 原核细胞 Ca处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 转化过程 4.目的基因的检测与鉴定
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基因工程操作过程中的几个易错点
(1)目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。
(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象：第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步存在检测分子水平杂交。
(3)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染植物细胞，并将其Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。
(4)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。
(5)标记基因的种类和作用：标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。
(6)受体细胞的选择：受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，也没有核糖体等细胞器，不能合成蛋白质。
(7)还应注意的问题有：①基因表达载体中，启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。②基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。
1．(2015·高考四川卷，9，11分)将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如下图所示(注：农杆菌中Ti质粒上只有T-DNA片段能转移到植物细胞中)。
(1)过程①需用同种________________酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。为将过程②获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用________培养基。
(2)过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让________进入棉花细胞；除
8
尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。 (3)若过程④仅获得大量的根，则应在培养基中增加________________以获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是________________________________________________________________________。
(4)检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是________。种植转基因抗虫棉能减少________的使用，以减轻环境污染。
解析：(1)切割目的基因和载体应使用同种限制性核酸内切酶，筛选细菌应使用选择培养基。(2)农杆菌转化法的原理是农杆菌感染植物时，Ti质粒上的T-DNA片段能够转移并整合到植物细胞的染色体DNA上。因为T-DNA上具有卡那霉素抗性基因，所以可用含卡那霉素的培养基筛选出获得T-DNA片段的植物细胞。(3)植物组织培养过程中，可加入激素调节植物细胞的脱分化和再分化。生长素用量比细胞分裂素用量，比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值低时，有利于芽的分化、抑制根的形成。幼嫩的芽顶端可以产生生长素并向基部运输，促进根的分化，故芽在无激素的培养基中也可以生根。(4)在个体水平上检测抗虫棉时可在抗虫棉上投放害虫来判断其是否具有抗虫的性状；抗虫棉因具有抗虫性状，故可减少农药的使用，以减轻环境污染。
答案：(1)限制性核酸内切 选择 (2)T-DNA 筛选获得T-DNA片段的植物细胞 (3)细胞分裂素浓度 芽顶端合成的生长素向基部运输，促进根的分化 (4)投放棉铃虫 农药
2．(2014·高考山东卷，36，改编，12分)人组织纤溶酶原激活物(htPA)是一种重要的药用蛋白，可在转htPA基因母羊的羊乳中获得。流程如下：
(1)htPA基因与载体用____________________________切割后，通过DNA连接酶连接，以构建重组表达载体。检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，可采用__________________技术。
(2)将重组表达载体导入受精卵常用的方法是________。为了获得母羊，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行________。利用胚胎分割和胚胎移植技术可获得多个转基因个体，这体现了早期胚胎细胞的________。
(3)若在转htPA基因母羊的羊乳中检测到________，说明目的基因成功表达。
解析：(1)用同种限制性核酸内切酶对目的基因和载体进行切割，以形成相同的黏性末端。检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，常用DNA分子杂交技术。(2)将重组表达载体导入受精卵(动物细胞)常用的方法是显微注射法。为了获得母羊，需要对胚胎进行性别鉴定。利用胚胎分割和胚胎移植技术可获得多个转基因个体，依据的原理是早期胚胎细胞的全能性。(3)目的基因成功表达的标志是在转基因母羊的羊乳中检测到htPA，即人组织纤溶酶原激活物。
答案：(1)同种限制性核酸内切酶(或同种限制酶) DNA分子杂交(或核酸探针) (2)显微注射法 性别鉴定 全能性
(3)htPA(或人组织纤溶酶原激活物)
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考点三 蛋白质工程[学生用书P276]
蛋白质工程与基因工程的比较 (1)区别 项目 过程 蛋白质工程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列 定向改造或生产人类所需的蛋白质 可生产自然界没有的蛋白质 基因工程 获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品 只能生产自然界已有的蛋白质 实质 结果 (2)联系
①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。 ②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
(2015·高考全国卷Ⅱ，40，15分)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：________________________________________________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________________和________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
解析：(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。中心法则的内容如下图所示：
由图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自
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我复制(如烟草花叶病毒等)，在某些病毒中能以RNA为模板逆转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。
答案：(1)氨基酸序列(或结构)(其他合理答案也可)
(2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
, [学生用书P276])
1．(2016·陕西西工大附中适应性训练)绞股蓝细胞中含有抗烟草花叶病毒(TMV)基因，可以合成一种抗TMV蛋白，叶片对TMV具有抗感染性。烟草是重要的经济作物，由于TMV的感染会导致大幅度减产。研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV的烟草，主要流程如图所示。
(1)科学家首先从绞股蓝细胞中提取抗TMV基因转录的RNA，然后合成目的基因。图中过程①表示________，获得的DNA必须在两侧添加________和________。
(2)过程③构建重组Ti质粒时，必须使用________________________和________________________________两种工具酶。
(3)由图分析，在过程③构建的重组Ti质粒上应该含有卡那霉素抗性基因作为________，重组Ti质粒导入烟草体细胞的方法是________________________________________________________________________。
(4)在过程⑤培养基中除含有卡那霉素及植物必需的各种营养成分外，还必须添加________，以保证受体细胞能培养成再生植株。
(5)过程⑥可采取________________的方法，检测植株是否合成了抗TMV蛋白。在个体水平的鉴定过程中，可通过________________的方法来确定植株是否具有抗性。
解析：(1)利用mRNA获得目的基因的方法是逆转录法，目的基因的两端要分别有启动子和终止子。(3)质粒上的抗性基因常用作标记基因。(5)检测目的基因是否完成了表达常用抗原—抗体杂交的方法检测是否合成了特定的蛋白质；常用接种实验从个体水平上检测植株是否具有抗病性。
答案：(1)逆(反)转录 启动子 终止子 (2)限制性核酸内切酶(限制酶) DNA连接酶 (3)标记基因 农杆菌转化法
(4)植物激素(生长素和细胞分裂素) (5)抗原—抗体杂交 接种烟草花叶病毒
2．(2016·福建普高毕业班质检)为探究SHH基因与角化囊肿发生的相关性，科研人员
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利用SHH基因的非模板链转录合成的RNA作为探针，进行分子杂交实验，以检测SHH基因在角化囊肿中的表达情况。其基本流程如图：(Amp表示氨苄青霉素抗性基因；LacZ基因被SHH基因插入后不表达)
请回答：
(1)重组载体中SHH基因转录合成RNA探针时，________(需要/不需要)启动子。
2＋
(2)步骤②中，用Ca处理大肠杆菌，使之成为________细胞，然后导入重组载体。实验中，用添加氨苄青霉素的培养基培养大肠杆菌，未导入质粒的细菌将会死亡，原因是这些细菌不含有________基因。
(3)将制备的探针加入角化囊肿切片中，探针将与__________________形成杂交带，进而判断SHH基因的转录情况。
2＋
解析：(1)重组载体中SHH基因表达需要启动子。(2)大肠杆菌细胞用Ca处理后就成为感受态细胞；能在添加氨苄青霉素的培养基上生存的细菌含有氨苄青霉素抗性基因，没有氨苄青霉素抗性基因的细菌将会死亡。(3)判断SHH基因的转录情况，也就是判断SHH基因是否转录出mRNA。
答案：(1)需要
(2)感受态 Amp(或氨苄青霉素抗性或抗性) (3)SHH转录的mRNA(只写mRNA不可)
3．已知甲种农作物因受到乙种昆虫危害而减产，乙种昆虫食用某种原核生物分泌的丙种蛋白质后死亡。因此，可将丙种蛋白质基因转入到甲种农作物体内，使甲种农作物获得抗乙种昆虫危害的能力。回答下列问题：
(1)为了获得丙种蛋白质的基因，在已知丙种蛋白质氨基酸序列的基础上，推测出丙种蛋白质的________序列，据此可利用________方法合成目的基因。获得丙种蛋白质的基因还可用________和________方法。
(2)在利用上述丙种蛋白质基因和质粒载体构建重组质粒的过程中，常需要使用________酶和________酶。
(3)将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共同培养，筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织，由该愈伤组织培养成的再生植株可抵抗________的危害。
(4)若用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口，则该植株的种子________(填“含有”或“不含”)丙种蛋白质基因。
解析：(1)获取目的基因的方法主要有基因文库获取法、PCR技术扩增法和人工化学合成法三种。已知丙种蛋白质氨基酸序列，可通过推测丙种蛋白质的基因序列，然后利用化学方法人工合成丙种蛋白质基因。(2)在构建重组质粒的过程中，需要使用限制性核酸内切酶和DNA连接酶，前者能识别特定的核苷酸序列，使每条链特定部位的核苷酸之间的磷酸二酯键断开形成黏性末端，被喻为“分子手术刀”；后者能使两个带有相同黏性末端的DNA片段连接起来，被称为“分子缝合针”。(3)将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共同培养，可筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织，而后培养出含有丙种蛋白质的抗乙种昆虫的植株。(4)若只用重组质粒感染甲种农作物叶片伤口，可在叶片组织中筛选出含丙种蛋白质的细胞，由于该重组质粒感染的是体细胞，故该植株的种子中不含有丙种蛋白质基因。
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答案：(1)基因 化学 基因文库 PCR (2)限制 DNA连接 (3)乙种昆虫 (4)不含
1．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有______________和________________________________________________________________________。
(2)质粒运载体用EcoR Ⅰ切割后产生的片段如下：
AATTC……G G……CTTAA
为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR Ⅰ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。 (3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。
(4)逆转录作用的模板是________，产物是________。若要在体外获得大量逆转录产物，常采用________技术。
(5)基因工程中除质粒外，____________和______________也可作为运载体。
(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。 解析：(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种类型。(2)为使运载体与目的基因相连，应使二者被切割后产生的末端相同，故用另一种限制酶切割产生的末端必须与EcoR Ⅰ切割产生的末端相同。(3)根据酶的来源不同，DNA连接酶分为E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。(4)以RNA为模板，合成DNA的过程称为逆转录，若要在体外获得大量DNA分子，可以使用PCR技术。(5)在基因工程中，通常利用质粒作为运载体，另外λ噬菌体的衍生物和动植物病毒也可作为运载体。(6)大肠杆菌作为受体细胞
2＋
时，常用Ca处理，使之成为能吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞。
答案：(1)黏性末端 平末端
(2)切割产生的DNA片段末端与EcoR Ⅰ切割产生的相同(其他合理答案也可) (3)E·coli T4
(4)mRNA(或RNA) cDNA(或DNA) PCR
(5)λ噬菌体的衍生物 动植物病毒(其他合理答案也可)
(6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱(其他合理答案也可)
2．(2016·靖江模拟)许多大肠杆菌的质粒上含有lacZ基因，其编码的产物β-半乳糖苷酶在X-gal和IPTG存在的条件下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。基因工程中常利用该原理从导入质粒的受体细胞中筛选出真正导入重组质粒的细胞，过程如图所示。请据图回答下列问题：
13
(1)基因工程中，构建基因表达载体的目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
↓
(2)限制酶EcoR Ⅰ的识别序列和切割位点是—GAATTC—，SmaⅠ的识别序列和切割位
↓
点是—CCCGGG—。图中目的基因被切割下来和质粒连接之前，需在目的基因的右侧连接相应的末端，连接的末端序列是________，连接过程中需要的基本工具是________________________________________________________________________。
(3)转化过程中，大肠杆菌应先用____________处理，使其处于能吸收周围DNA的状态。 (4)菌落颜色为白色的是____________，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。 (5)菌落③中的目的基因是否表达，可采用的检测办法是____________。 解析：(1)基因工程中，构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，能遗传给后代，并表达和发挥作用。(2)根据限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ的识别序列、切割位点和图解判断，图中目的基因被切割下来和质粒连接之前，需在目的基因的右侧连接相应的末端，连接的末端序列是—TTAA，连接过程中需要的基本工具是DNA连接酶。(3)转化过程中，
2＋
大肠杆菌应先用Ca处理，使其处于能吸收周围DNA的状态。(4)由于lacZ标记基因区插入外源基因后被破坏，不能表达出β-半乳糖苷酶，故菌落③为白色菌落。(5)可采用抗原—抗体杂交的办法检测菌落③中的目的基因是否表达。
答案：(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，能遗传给后代，并表达和发挥作用 (2)—TTAA DNA连接酶
2＋
(3)Ca (4)菌落③ lacZ标记基因区插入外源基因后被破坏，不能表达出β-半乳糖苷酶，故菌落为白色
(5)抗原—抗体杂交 3．(2016·山东日照一模)下图表示利用细菌中抗虫基因获取抗虫玉米的部分过程(①～⑧表示操作流程，a、b表示分子，c～e表示培养过程，其中过程d表示细菌与玉米细胞混合培养)，请回答：
(1)上述操作中，获取目的基因的方法可能是______________________。流程③用到的工具酶为
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________________________________________________________________________。
(2)过程d指的是基因工程基本操作程序中的________________，本过程中用到的方法是________________________________________________________________________。
(3)流程⑦中需要的培养基有________种，与动物细胞培养液显著不同的是该培养基中含有________，从而促进根、芽的分化。
(4)图示过程中涉及的生物技术有________和________________________________________________________________________。
解析：(1)图中a、b表示质粒(载体)和基因表达载体。获取目的基因的方法有多种，可以直接从基因文库中获取抗虫基因。流程③为目的基因和质粒重组，需要用到DNA连接酶。(2)过程d是指将目的基因导入受体细胞，将目的基因导入植物细胞常使用的方法是农杆菌转化法。(3)流程⑦为植物组织培养过程，需要分别诱导愈伤组织形成和诱导愈伤组织分化，因此需用不同的培养基。通过添加不同浓度比例的植物激素可以促进根、芽的分化。(4)图中涉及的生物技术包括基因工程和植物组织培养。
答案：(1)直接获取(从基因文库中获取等) DNA连接酶 (2)将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法 (3)2 植物激素
(4)基因工程 植物组织培养
4．(2016·山东泰安模拟)设计并生产更加符合人类需要的蛋白质具有极为广阔的应用前景。利用胚胎工程技术生产预期蛋白质的流程如图所示。
(1)过程①～⑤所示的生物工程为________________________________________________________________________。
该工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过______的修饰或合成，对现有的________进行改造，或制造出一种新的蛋白质，以满足人类生产生活的需求。
(2)若预期蛋白质欲通过乳腺生物反应器生产，需在过程⑨之前，对精子进行筛选，以保留含________染色体的精子并对精子进行________处理。
(3)若过程⑥中的卵母细胞来自从屠宰场收集的卵巢，则在过程⑧之前，需进行体外培养到________________期方能受精。为提高培育成功率，进行⑩过程之前，要对供、受体动物进行________处理。
(4)用胚胎分割技术处理发育到________期或囊胚期的早期胚胎并进行胚胎移植，可获得同卵双胎或多胎。
解析：(1)蛋白质工程通过基因的修饰或合成，对现有的蛋白质进行改造，或制造出一种新的蛋白质，以满足人类生产生活的需求。(2)若通过乳腺生物反应器生产预期蛋白质，需要获得雌性个体，即使获能的X精子与卵子受精。(3)体外获得的卵子要培养到减数第二
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次分裂中期才可与获能的精子受精。(4)利用胚胎分割技术将发育到桑椹胚期或囊胚期的早期胚胎进行分割、移植，可获得同卵双胎或多胎。
答案：(1)蛋白质工程 基因 蛋白质 (2)X 获能
(3)减数第二次分裂中 同期发情 (4)桑椹胚
5．病毒疫苗的研制是现代生物技术应用最广泛的领域，现在研发的第二、三代病毒疫苗都基于DNA重组技术而建立。请分析回答下列问题：
(1)第二代疫苗是以编码病毒抗原蛋白的RNA为模板，经________酶的作用获得目的基因，再利用______________________这些工具酶构建重组质粒。形成的重组质粒与经过____________________处理的大肠杆菌细胞混合转化大肠杆菌，扩增大肠杆菌以获得大量的抗原蛋白。
(2)在构建好的重组质粒中，引导目的基因表达的序列是________，它是________的识别和结合位点。
(3)第三代疫苗即“DNA疫苗”，是将编码某种抗原蛋白的DNA注射到动物体内，该DNA可在人体内________出相应的抗原蛋白。
(4)现代对于基因工程产品安全性的争论越来越激烈，目前转基因生物的安全性主要体现在________、________、________三个方面。
答案：(1)逆转录 限制酶和DNA连接酶 氯化钙溶液 (2)启动子 RNA聚合酶 (3)转录、翻译
(4)食物安全 生物安全 环境安全
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